ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒检测中的应用比较分析

褚文达

（上海市宝山区疾病预防控制中心微生物检验科，上海201901）

ELISA法和RT-PCR法在麻疹病毒检测中的应用比较分析

褚文达

（上海市宝山区疾病预防控制中心微生物检验科，上海201901）

目的 探讨酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和实时荧光定量PCR（quantitative realtime PCR，RT-PCR）对疑似麻疹病例的麻疹病毒的检测，为疾病的尽早确诊及治疗提供实验依据。方法 以上海市宝山区2014年4月至2015年12月的250例疑似麻疹病例为研究对象，采集其血清标本和咽拭子标本，分别应用ELISA法检测患者血清中的麻疹特异性的免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗体和RT-PCR法检测咽拭子中麻疹病毒的核酸。结果 250例疑似麻疹病例，排除风疹病毒阳性的34例病例，其中麻疹病毒（measles virus，MV）IgM抗体呈阳性的有80例，阳性率为37.04%；MV RT-PCR呈阳性的有128例，阳性率为59.26%。RT-PCR的检测阳性率显著高于IgM检测（χ2=41.14，P＜0.001）。结论 RT-PCR法可快速诊断麻疹病毒的病原学，且对出疹初期麻疹IgM呈阴性的病例可进一步确诊，是一种有效可靠的方法。

麻疹病毒； 酶联免疫吸附试验； 实时荧光定量PCR； 血清； 核酸

麻疹病毒（measles virus，MV）感染临床上可引起发热及出疹为特征的急性病毒性呼吸道传染病，其发病率之高，传染性之强，已属于我国计划免疫的病毒之一。对麻疹进行早期诊断，并采取一定的预防措施，能有效减少麻疹的暴发。但由于风疹病毒（rubella virus，RV）与麻疹病毒的临床症状相似，常易引起混淆，因此区分二者需要进行特异性实验室诊断。目前实验室对麻疹病毒的诊断主要有血清学方面的诊断和病原学方面的诊断［1-3］。在麻疹的防治工作中，有研究［4］表明选择合适的抗体能显著提高检测的阳性率。IgG抗体由于检测步骤复杂，人为误差较大，并且需要双份血清，采血时间引起误差，导致检测阳性率较低，尤其在麻疹早期诊断中，与IgG相比，特异检测IgM抗体更有效

帮助麻疹的确诊。目前我国建立的麻疹实验室网络，是利用ELISA对患者血清中的麻疹特异性的IgM抗体进行检测［5］。RT-PCR是一项于近年迅速发展的高特异性、高灵敏度的对核酸进行快速检测的技术，其优点是普通定量PCR无法达到的，现已广泛应用于病毒等各种病原微生物核酸的快速检测［6］。本文以宝山区 2014年 4月至2015年 12月的疑似麻疹病例为研究对象，分别应用ELISA法检测患者血清中的麻疹特异性的IgM抗体和RT-PCR法检测麻疹病毒的核酸，并进一步探讨两种检测方法的检测效果。

材料和方法

1 一般资料

本组250份标本来源于宝山区2014年4月至2015年12月的疑似麻疹病例，其中男160例，女90例，平均年龄10.8±3.3岁。出疹后14天内进行血标本采集，用于ELISA法检测患者血清中的麻疹特异性的IgM抗体；出疹后5天内进行咽拭子标本采集，用于RT-PCR法检测麻疹病毒核酸，同时利用两种方法检测标本中的风疹病毒，以排除风疹病毒的干扰。

2 仪器与试剂

Bio-Tek（ELX-808）酶标仪（货号：196682）；ABI 7500荧光定量PCR仪；麻疹病毒IgM抗体检测试剂盒购于珠海经济特区海泰生物制药有限公司（产品编号：YZB/国6817-2012）；风疹/麻疹病毒 RNA检测试剂盒（荧光PCR法）购于江苏硕士生物科技有限公司。

3 方法

3.1 ELISA法检测血清IgM抗体 ①血清标本处理：无菌注射器抽取患者静脉血，4℃离心，2 000 r/min，10 min，取血清。②ELISA法检测：严格按照麻疹病毒IgM抗体检测试剂盒说明书进行操作，结束后以空白调零，用酶标仪读出450 nm处的吸光度值，或者通过（A450nm-A630nm）计算吸光度值，通过该吸光度值判定检测结果。

3.2 RT-PCR检测麻疹病毒核酸 ①咽拭子的采集：无菌棉签蘸取患者咽部分泌物，避免触及口腔黏膜、舌和唾液。加入至3～5 mL病毒标本保存液中，在靠近顶端处折断棉签，后按照Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit（货号：52904）提取试剂盒提取RNA，用于后续扩增。②RT-PCR法检测：严格按照麻疹病毒RNA检测试剂盒说明书进行操作，反应体系配置完成后于PCR仪进行扩增，反应条件：逆转录：50℃，30 min，1个循环；预变性：95℃，5 min，1个循环；变性、退火、延伸：95℃，10 s，55℃，共45个循环；在55℃时收集荧光信号，检测通道为：FAM，VIC，ROX（注：PCR仪设置时不选ROX校正，淬灭基团选None）。

4 统计学处理

所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计数资料以例数（百分数）的形式表示，配对资料采用配对组χ2检验。P＜0.05有统计学意义。

结 果

1 不同样本ELISA和RT-PCR法检测结果

共收集250例疑似麻疹病例的血液标本和咽拭子标本，排除两种方法检测风疹病毒为阳性的34例病例，从而排除风疹干扰因素。剩余的216份血清标本中MV IgM抗体呈阳性的有80例，阳性率为37.04%，其中有四份可能为假阳性；216份咽拭子标本中 MV RT-PCR呈阳性的有128例，阳性率为59.26%。两方法检验结果具有显著性差异，RT-PCR的检测阳性率较高（χ2=41.14，P＜0.001），见表1。

表1 不同样本ELISA和RT-PCR法检测结果比较

2 检测时间分析

由上述MV IgM检测结果呈阴性而 RT-PCR检测结果呈阳性的52份标本发现，其中46份标本的检测时间处于发病的1～5 d，见表2。

表2 检测时间比较

讨 论

麻疹病毒样本一般通过血液或鼻咽分泌物来采集，早期研究表明，在麻疹前驱期或者患者机体出现皮疹第1天，病人血液或者呼吸道分泌物易分离出麻疹病毒［7］。

对上海市宝山区2014年4月至2015年12月250份麻疹疑似病例，在发病2周内采集静脉血或咽拭子，分别采用ELISA法检测血清样本中IgM抗体和采用实时荧光RT-PCR法检测咽拭子样本中麻疹病毒核酸。本实验结果显示，ELISA法检测麻疹病毒阳性率显著低于RT-PCR法对麻疹病毒核酸的检测。通过RT-PCR法检测为阳性结果的128例患者中，有52例患者麻疹病毒IgM抗体的检测结果为阴性，其原因为患者在感染麻疹病毒之后，麻疹IgM抗体在发病早期较少产生或者不产生，并且抗体产生带有个体差异性。有文献报道，出疹3d内，通过麻疹IgM抗体来检测麻疹病毒可能出现的假阳性结果高达30%［8］。因此，在患者发病早期，通过血清样本检测麻疹IgM抗体来进行确诊并不十分可靠，可能会出现漏检［9］。若临床上仍采用麻疹IgM抗体进行确诊，则应在出疹之后4d到28d再次进行麻疹IgM抗体检测，抗体检测的时间跨度一般较长［10］。所以，ELISA法对麻疹确诊具有局限性，不仅早期检测结果不理想，而且耗时长，患者对抽血有排斥感，另外，病毒血症可能会在患者出疹前7d出现，出疹1～2 d内，中和抗体出现在血清中，血循环中病毒可能消失，因此出疹可能是由于体内出现抗体-病毒复合物这种炎症物质［11］，所以医生在实际操作中需把握好患者就诊和采血时间等。

采用RT-PCR法检测麻疹病毒核酸来对患者进行确诊，不仅方便易行，检测的特异性和灵敏度均高于ELISA检测。RT-PCR法能够在发热仅1d的小儿样本中检测出麻疹病毒［12］，可用于麻疹病毒核酸早期的快速诊断及筛查，如果病例为阳性则不需要再检测IgM抗体即可确诊，而ELISA法可作为RT-PCR法的有力补充。另外对于一些患者的血清IgM抗体呈阴性可进一步通过RT-PCR进行检测，达到弥补漏检的目的［13-14］。虽然RT-PCR能提高特异性检测，但是如果模板序列中有碱基发生变异，则RTPCR过程中，探针就不能有效结合模板，从而导致假阳性。因此，对某些基因变异发生率较高的微生物，如病毒等，设计引物的难度与真核生物相比大幅增加。另外，本研究的样品量较少，研究结果不够全面，仍需进一步扩大样本量进行深入研究。

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（潘子昂编辑）

Comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay（ELISA）and Real-time PCR Assay（RT-PCR）in the Detection of Measles Virus

CHU Wen-da
（Center for Disease Control and Preventionof Baoshan District Shanghai，Shanghai 201901，China）

Objective To explore the measles virus of suspected measles cases through ELISA and the RT-PCR to provide scientific experimental basis for taking immediate measures to control outbreak of measles.Methods Venous blood and throat swab specimens were collected from 134 suspected measles cases in Baoshan，Shanghai from Apr.2014 to Dec.2015.Serum measles IgM was detected by ELISA.Measles viral RNA from throat swab specimens was detected by RT-PCR.Results From 250 cases of suspected measles，80 measles virus IgM antibody detected by ELISA method was positive with the positive rate of 37.04%，while 128 measles virus nucleic acid was positive with the positive rate of 59.26%.The positive rate of RT-PCR was significantly higher than that of IgM（χ2=20.83，P＜0.001）.Conclusion RT-PCR is a rapid method for diagnosis of measles virus.It can further confirm the initial IgM negative measles rash cases，which is effective and reliable.

Measles virus； Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）； Real-time fluorescent PCR assay（RT-PCR）； Serum； Nucleic acid

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.11.032

2016-06-20；

2016-08-03