吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、松脂酸铜复配对杧果蒂腐病菌的毒力增效

叶火春　冯岗　杨佳何　王瑶　闫超　张静

摘 要 为延缓吡唑醚菌酯抗药性发展及科学防治杧果蒂腐病，探索吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、松脂酸铜对杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat.）毒力增效的最佳配方，采用菌丝生长速率法测定吡唑醚菌酯、嘧菌环胺及松脂酸铜对杧果蒂腐病菌的室内毒力，并在此基础上，采用Horsfall法定性筛选复配药剂的增效比例，以孙云沛共毒系数法测定联合毒力并确定最佳复配比例。结果表明：吡唑醚菌酯与嘧菌环胺增效配比体积为7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9，其中以6∶4增效作用最显著，CTC值达880.96；吡唑醚菌酯与松脂酸铜按Horsfall法设计9种配比均无拮抗作用，除配比8∶2为相加作用外，其他配比均表现为不同程度的增效作用，其中以3∶7增效毒性比率最大，CTC值为430.30，增效显著。吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、松脂酸铜2种杀菌剂复配对杧果蒂腐病菌最佳毒力增效配比体积分别为6∶4和3∶7。

关键词 吡唑醚菌酯 ；嘧菌环胺 ；松脂酸铜 ；可可球二孢菌 ；联合毒力

中图分类号 S482.2+99 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.10.009

Abstract Pyraclostrobin was mixed with cyprodinil or copper abietate to prepare a mixed fungicide against mango stem end rot caused by Botryodiplodia theobroma to reduce the tolerance of pyraclostrobin against the disease. The toxicity of the mixed fungicides to B. theobroma Pat was determined by using mycelium growth rate test. Horsfall design method and Sun-Johnson method were used to evaluate the synergistic effect of the fungicides against B. theobroma Pat and to screen the mixed fungicides with higher synergistic interaction. The result showed that the mixtures of pyraclostrobin and cyprodinil had synergistic effect at the ratio of 7∶3， 6∶4， 5∶5， 3∶7， 2∶8 and 1∶9， of which the mixture at the ratio of 6∶4 had the best synergistic effect with co-toxicity coefficient （CTC） being 880.96. The results of the Horsfall method showed that the mixtures of pyraclostrobin and copper abietateon exhibited no antagonistic effect but synergistic interaction except the mixture at the ratio of 8∶2 which showed additive effect. Among these mixed fungicides， the fungicide mixed at the ratio of 3∶7 had the CTC value of 430.30 and showed significant synergistic interaction in controlling the disease. Therefore， the optimal synergistic proportions of the mixtures of pyraclostrobin with cyprodinil or copper abietateon against B. theobroma Pat were 6∶4 or 3∶7.

Keywords Pyraclostrobin ； Cyprodinil ； Copper abietate； Botryodiplodia theobroma ； Co-toxicity

由可可球二孢菌（Botryodiplodia theobromae Pat）引起的杧果蒂腐病是一种严重威胁杧果贮藏期果品的重要病害[1]。该病害具有潜伏侵染的特性，在果实成熟期才呈现发病症状，使其防治困难[2]。近年来，吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）作为防治芒果蒂腐病害推荐用药之一，良好的防效使得该药的使用次数和使用量不断增加。然而，吡唑醚菌酯属于呼吸抑制剂，作用靶标单一，被杀菌抗性行动委员会归类为具有高抗药风险的药剂[3]。嘧菌环胺是（Cyprodinil）新一代嘧啶胺类内吸性杀菌剂，主要作用机理为抑制真菌水解酶分泌和蛋氨酸的生物合成，与三唑类、吗啉类、甲氧基丙烯酸酯类等多类已知杀菌剂无交互性抗性[4]。松脂酸铜（Copper abietate）是一种广谱保护性有机铜杀菌剂，主要以释放铜离子抑制病原菌的蛋白质合成及酶活性，属于多作用位点杀菌剂，尚无抗药性产生[5]。杀菌剂的合理复配既可有效延缓抗药性产生，还可提高防效，扩大防治谱，降低成本[6]。为此，本实验开展吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、松脂酸铜复配对杧果蒂腐病菌的联合毒力研究，旨在寻找吡唑醚菌酯2种混剂的最佳增效配比，为防治杧果蒂腐病新型混剂的研发提供理论依据，并将有利于延长吡唑醚菌酯、嘧菌环胺等内吸性杀菌剂的使用寿命，提高松脂酸铜对病害的防效。

吡唑醚菌酯是巴斯夫公司开发的一种高效、广谱、低毒的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有保护、治疗和叶片渗透传导作用，并对作物具有保健增产作用[7]。然而，吡唑醚菌酯作用位点单一，抗药风险性高。Avenot等[8]从加利福尼亚州地区曾经使用过吡唑醚菌酯的开心果果园中，分离获得59株开心果晚疫病菌发现，其中56株对吡唑醚菌酯表现出抗药性，EC50值在53 μg/mL以上。同样，Fernández-Ortuno等[9]，发现分离于南北卡罗来纳州草莓上的218株草莓灰霉病菌对吡唑醚菌酯抗药性菌株达到了66.7%。目前，与其他不同作用机理的杀菌剂复配成为国内外对吡唑醚菌酯研发的重点，巴斯夫公司近年先后推出多款吡唑醚菌酯复配产品，与其配伍的杀菌剂主要包括，氟环唑、代森联、啶酰菌胺、灭菌丹、烯酰吗啉、丁苯吗啉、氟环唑+醚菌酯等[7]。吉沐祥等[10]开展了吡唑醚菌酯与枯草芽孢杆菌对草莓枯萎病的增效配方筛选及混剂使用技术研究，结果显示，20%吡唑醚菌酯与200亿cfu/g枯草芽孢杆菌以1∶1配比增效作用最高，推荐灌根浓度为1 000～2 000倍液。赵建江等[11]明确了吡唑醚菌酯与啶酰菌胺混配对灰葡萄孢以质量比为1∶2时，增效最明显，在240～300 g a.i./hm2对番茄灰霉病具有良好的防治效果。陈娟芳等[12]筛选出吡唑醚菌酯与甲基硫菌灵以质量比为1∶8时，对辣椒炭疽病菌的菌丝生长和孢子萌发均有增效作用。

当前，防控杧果蒂腐病危害仍主要依赖于化学防治，常规用药如多菌灵、烯唑醇和嘧菌酯等高效、靶标单一的杀菌剂。由于长期重复使用，致使该病原菌已对其产生不同程度的抗药性[13]，尤其以苯并咪唑类杀菌剂更为突出。为了持续、有效地防控该病害发生及危害，采用杀菌剂间复配或者轮用的措施很有必要，实施前提则是丰富防治该病害药剂库[14]。胡美娇和师超等[2，15]在对该病防治药剂筛选中，均推荐吡唑醚菌酯作为防治该病害首选药剂之一。台湾马米果嫁接苗梢枯病是同杧果蒂腐病原菌Botryodiplodia theobromae Pat（=Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Griff. & Maubl）引起的，Tovar-Pedraza等[16]对该病害药剂筛选研究中发现，12种杀菌剂中以咯菌腈与嘧菌环胺混剂62.5%赛普护汰宁的毒力最高， EC50为0.004 3 μg/mL，吡唑醚菌酯与啶酰菌胺混剂次之，平均EC50为0.014 μg/mL。同样，62.5%赛普护汰宁对由该种病原菌引起的木瓜蒂腐病亦具有较强的抑菌效果[17]。目前，鲜有吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、吡唑醚菌酯与松脂酸铜2种复配制剂及其对杧果蒂腐病菌联合毒力的研究报道。为此本研究开展筛选吡唑醚菌酯与嘧菌环胺、吡唑醚菌酯与松脂酸2种复配的增效比例，确定增效较高的组合，测定这些组合对杧果蒂腐病菌的联合毒力，最终确定吡唑醚菌酯2种混剂的最佳复配比例。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

杧果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobroma Pat）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所采后病理及保鲜实验室提供，斜面低温保存，转接至平板培养2 d备用。

1.1.2 药剂

98%吡唑醚菌酯原药，购自山东潍坊双星农药有限公司；98%嘧菌环胺原药，购自瑞士先正达作物保护有限公司。上述2种药剂分别用丙酮配制为1.00×104 μg/mL母液，备用。23%松脂酸铜乳油，由山东禾宜生物科技有限公司提供。

1.1.3 培养基

PSA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉18 g、蒸馏水1 L。

1.2 方法

1.2.1 杀菌剂单剂室内毒力测定

采用菌丝生长速率法[18]。在预试的基础上，将吡唑醚菌酯和嘧菌环胺母液用0.1%吐温-80无菌水2倍梯度稀释，在含药PSA平板中浓度设置为20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/mL，而松脂酸铜乳油则用无菌水配制成2 000、1 000、500、250、125 μg/mL的含药PSA平板。在活化2 d的杧果蒂腐病菌菌落边缘制取直径为4.0 mm的菌块，转接于含药平板中，各处理重复3次，以不加药剂的平板为对照，于28℃培养48 h，采用十字交叉法测量菌落直径，按照下列公式计算菌丝抑制率，并采用EXCEL数据处理，通过抑制率的机率值和药剂浓度对数之间的线性回归分析，求得药剂的EC50和EC90值。

1.2.2 复配杀菌剂增效比例筛选

根据Horsfall[19]法设计复配比例，生物测定同1.2.1。将吡唑醚菌酯与嘧菌环胺2种单剂分别以0.1%吐温-80无菌水溶液配制剂量浓度与其EC50相同或相近的药液，药液以体积比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 、9∶1、0∶10等11种比例复配处理供试菌，以不加药剂的处理为对照，重复3次；吡唑醚菌酯与松脂酸铜复配方法同上，并计算各复配药剂的抑制率及毒性比率TR（实际抑制率/理论抑制率）。当TR值大于1为增效作用；等于1为相加作用；若小于1为拮抗作用。

1.2.3 复配药剂共毒系数测定

复配药剂选取毒性比率较高的3个配比药剂，设置5个浓度梯度，重复3次，以不加药剂为空白对照，生物活性测定同1.2.1，计算复配药剂的EC50。根据上述测定结果，采用孙云沛法计算复配药剂共毒系数（CTC），以CTC值大小评价复配药剂的增效作用，并确定最佳药剂复配配比。评价标准[20]：CTC≥200，为显著增效作用；120≤CTC<200，为略微增效作用；80

式中，A、B药剂为复配的单剂；A%和B%分别为A、B单剂在混合药剂中的含量；标准药剂以其中一种单剂进行计算。

2 结果与分析

2.1 3种杀菌剂对杧果蒂腐病菌室内毒力

结果显示：吡唑醚菌酯和嘧菌环胺2种单剂对杧果蒂腐病菌菌丝生长均具有良好的抑制活性，其EC50值分别为2.59和6.37 μg/mL；而松脂酸铜对其抑菌效果较差，其EC50值为565.67 μg/mL；吡唑醚菌酯和嘧菌环胺抑菌活性明显高于松脂酸铜，如表1所示。

2.2 复配杀菌剂毒性比率测定结果

基于各单剂EC50值，吡唑醚菌酯、嘧菌环胺和松脂酸铜分别配制成2.60、6.50和500.00 μg/mL等3种单剂药液。经Horsfall法筛选结果表明，吡唑醚菌酯与嘧菌环胺复配以体积比为4∶6时，呈现相加作用，而以配比为7∶3、6∶4、5∶5、3∶7、2∶8和1∶9时，TR值均大于1，表现为增效作用，其中6∶4毒性比率最高，其次为2∶8和7∶3，如图1所示。吡唑醚菌酯与松脂酸铜组合除配比8∶2表现为相加作用外，其他配比均有不同程度的增效作用，其中以配比3∶7增效最明显，其次为4∶6和1∶9，如图2所示。

2.3 复配杀菌剂的联合毒力

如表2所示，吡唑醚菌酯与嘧菌环胺以7∶3、6∶4和2∶8三种配比复配时，以6∶4共毒系数最高，CTC达到880.96，增效显著，其对杧果蒂腐病菌毒力最强，EC50为0.47 μg/mL，而以7∶3配比复配时， CTC值为138.29，介于120与200，表现为略微增效；吡唑醚菌酯与松脂酸铜按1∶9、3∶7和4∶6三种配比复配时，共毒系数均大于200，表现为显著增效作用，增效顺序为3∶7>4∶6>1∶9，结果验证了Horsfall法筛选结果。这说明，松脂酸铜药剂添加少量吡唑嘧菌酯，可明显提高抑菌毒力。

3 结论与讨论

3.1 结论

吡唑醚菌酯与嘧菌环胺对杧果蒂腐病菌室内毒力最佳增效配比为6∶4，联合毒力优于2种单剂。吡唑醚菌酯与松脂酸铜复配对杧果蒂腐病菌毒力主要表现为增效作用，增效最显著的配比为3∶7，少量吡唑醚菌酯可明显提高松脂酸铜对杧果蒂腐病菌抑菌活性。

3.2 讨论

保护性杀菌剂能够阻止病菌的侵入，减轻病害的传播流行，但是对已侵入植物体内为害的病害，防治效果甚微，内吸性杀菌剂虽然能较好地控制病害流行为害，但病原菌对其抗药性问题不容忽视[21]。杀菌剂复配既可提高防效，减少成本，也可拓宽杀菌谱，延缓抗性，是解决上述问题的重要有效途径。

目前，大多数吡唑醚菌酯混剂研究是利用与其他作用位点不同的杀菌剂混合增强了药剂对病原菌生长干扰性而呈现增效作用。吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑混合使用呈现不同程度增效作用，质量比为1∶2混剂对马铃薯早疫病菌毒力增效、防效显著高于单剂防效，同时提高马铃薯产量，并对祁山药炭疽病菌同样具有增效作用[22-23]。王凯则选择了氰霜唑与吡唑醚菌酯复配，筛选出二者以4∶1复配对马铃薯晚疫病菌增效最显著[24]。本实验筛选了吡唑醚菌酯与嘧菌环胺复配增效比例，以6∶4复配时对杧果蒂腐病菌增效作用最高。

内吸治疗性杀菌剂与保护性杀菌剂合理复配，二者相得益彰，既延缓作用位点单一的内吸性杀菌抗药性，又提高了保护性杀菌防治效果。目前这一类混剂在我国登记的复配杀菌剂中较为常见，如60%吡唑·代森联WDG、50%唑醚·丙森锌WDG、18%咪鲜·松脂铜EC、75%多·锰锌WP、64%苯甲·锰锌WP等等。本研究中，吡唑醚菌酯与松脂酸铜复配增效作用明显，二者以3∶7复配时，增效最显著。结果显示，加入少量吡唑醚菌酯可提高松脂酸铜毒力作用，这种现象类似与小檗碱加入微量多菌灵即可增强其对桃褐腐病的抑制活性，其原因还有待进一步探究。本研究只在室内筛选药剂增效复配组合，其田间防治效果是否与室内毒力一致，对作物安全性以及增效作用机理等问题还有待进一步研究。

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