渗透休克法从大肠杆菌中提取GST—α1—TP5融合蛋白

谢琦　刘永明

摘要：目的：从大肠杆菌中选择性抽提GST-Tal-TP5融合蛋白。方法：采用渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Totl-TP5融合蛋白，优化操作条件，并与超声破碎法进行比较。结果：优化后的渗透休克法从大肠杆菌提取GST-TotI-TP5融合蛋白可使杂蛋白量含量相对超声破碎法降低一个数量级。结论：渗透休克法可高效提取大肠杆菌表达的GST-Tα1-TP5融合蛋白。

关键词：渗透休克法；大肠杆菌；谷胱甘肽硫转移酶；重组胸腺肽Tα1-TP5

中图分类号：R441.9；Q51；R378.21 文献标志码：A 文章编号：1008-2409（2015）04-0009-04

胸腺素α1（Tα1）是胸腺组分5（thvmosin fraction 5）中分离出来的由28个氨基酸残基组成的多肽，胸腺五肽（TP5）是胸腺生成素Ⅱ第32—36位的氨基酸残基片段。Tod和TP5均属免疫调节剂，临床上二者均被用于治疗免疫缺陷、肝炎、肿瘤和艾滋病等疾病。为了进一步研究二者的联合作用，本实验构建了与GST基因融合表达的重组胸腺肽Tα1-TP5表达菌株，在乳糖的诱导下实现了高效可溶性表达。

渗透休克法可选择性提取大肠杆菌周质空间蛋白，对简化后期纯化工艺十分有利。有文献报道采用渗透休克法提取重组大肠杆菌周质空间的青霉素G酰化酶，回收率92.4%，纯化倍数3.22。目前，大肠杆菌表达的GST融合蛋白大多采用超声破碎法，该法得到的粗酶液比活较低。本研究探讨用渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，并优化操作条件。

1材料与方法

1.1材料与试剂

大肠杆菌BL21（DE3）[PGEX-4T-1]，携带重组胸腺肽Tα1-TP5基因。

BCA蛋白质定量检测试剂盒购自上海生物工程公司；

TB培养基：酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氢钾17 mmol/L，磷酸氢二钾72 mmol/L，高压灭菌时磷酸盐与其他组分分开，待溶液冷却至60%以下后混合。

1.2实验方法

1.2.1培养条件 500ml三角瓶装TB培养基100ml，接种量0.5%，37℃，250 r/min，摇床培养，2.5 h后加终浓度1 dL乳糖诱导，继续培养6h后收集菌体。

1.2.2蛋白质含量测定 采用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定。

1.2.3 GST酶活测定采用分光光度法嘲测定GST-Tcx1-TP5融合蛋白的酶活。

1.2.4超声破碎细胞 离心收集菌体，20 mM Tris-HCL（pH 8.0）缓冲液洗涤离心，菌体重悬，冰浴超声破碎10 rain（工作30 s，间歇30 s），破碎后在14 000 r/min下冷冻离心10min，所得上清即为粗酶液。

1.2.5渗透休克法 发酵液离心去上清液，菌体用PBS洗涤1次后重悬于1/2发酵液体积的高渗溶液中，于25℃轻柔磁力搅拌30min，4℃12 000 r/min离心10min，弃高渗液，在菌泥中加入1/2发酵液体积的预冷的低渗溶液中，于冰浴中轻柔磁力搅拌一定时间，4℃14000 r/min离心10min，得上清液，为粗酶液。1.2.6蔗糖质量分数实验高渗溶液为100 mM Tris-HCl含10mM EDTA和不同质量分数（10%，20%，30%，40%，50%）的蔗糖，pH 9.0；低渗液为20 mMTris-HCL，pH 8.0；低渗提取时间为20min；实验方法见1.2.1和1.2.5。粗酶液进行12%SDS-PAGE分析。

1.2.7低渗液选择实验根据1.2.6的实验结果，高渗液所含蔗糖的质量分数为20%时，GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高，后续的条件优化以此为基础。

选择3种不同的低渗液进行比较，分别为水，pH6.9；20 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM PBS，pH 7.4。实验方法见1.2.1和1.2.5。粗酶液进行12%SDS-PAGE分析。

1.2.8低渗处理时间实验 根据1.2.7的实验结果，选择最优的低渗液，后续的实验以此为基础。

低渗提取时间选择10min，20min，30min，40min，50 min，60 min。实验方法见1.2.1和1.2.5。粗酶液进行12%SDS-PAGE分析。

1.2.9超声波法与渗透休克法的比较 将同一批发酵得到的菌体分别按1.2.4和1.2.5方法提取粗酶液，渗透休克法采用优化后的条件。所得粗酶液在同样条件下进行12%SDS-PAGE，按1.2.2方法测定蛋白质含量，按1.2.3法测定GST-Tα1-TP5融合蛋白酶活。

2结果与分析

2.1蔗糖质量分数的影响

渗透休克的操作中，高渗液蔗糖的质量分数是关键。为了进一步提高提取率，在配制不同蔗糖质量分数的高渗液时，加入终浓度100 mM Tris-HCl，调节高渗液的pH 9.0，同时还添加10mM的EDTA以增加细胞膜的通透性。实验结果见图1。

从SDS-PAGE电泳图谱分析可知，GST-Tα1-TP5融合蛋白的条带的强度在蔗糖质量分数为20%时最强，该条件下GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高。后续的实验高渗液蔗糖的质量分数均采用20%。

2.2低渗液的影响

采用2.1优选的高渗液处理后，比较3种低渗液的提取效果。实验结果见图2。根据SDS-PAGE电泳图谱，3种低渗液的提取效果为：20 mM Tris-HCl（pH 8.0）略优于水（pH 6.9）和20mMPBS（pH7.4）。又由于GST融合蛋白在20mMTris-HCl（pH 8.0）缓冲液中可以更好地保持酶活，利于后续酶活的测定和利用GST的特性进一步地精制纯化目的蛋白，所以本实验选择20mM Tris-HCL（pH 8.0）为最优的低渗液

2.3低渗处理时间的影响

不同低渗处理时间的结果见图3，根据SDS-PAGE电泳图谱分析，低渗提取时间选择10 min时，目的蛋白提取率明显低于20～60 min的提取率。当提取时间达到20 min以后，目的蛋白的提取率变化不大。说明周质蛋白从周质空间渗出并达到平衡大约需要20min，进一步延长时间，对提高目的蛋白的提取率作用不大，而且还会增加胞质蛋白的渗出，对纯化不利，所以最优的低渗处理时间选择20 min。

2.4超声波法与渗透休克法的比较

将同一批发酵得到的菌体分别按将优化后的渗透休克法与常规的超声破碎法提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，同样条件下进行SDS-PAGE电泳，结果见图4。同时测定两种方法提取粗酶液的蛋白含量和酶活，结果见表1。从电泳图谱可直观地看到渗透休克法提取的粗酶液比超声破碎细胞得到的粗酶液杂蛋白含量少得多。从表1的结果可知，两种方法提取的总酶活相差不大，但二者比活相差近10倍。

3讨论

大肠杆菌是表达重组蛋白常用的宿主菌，对于表达于大肠杆菌周质空间的重组蛋白，最好的抽提方法是在保持细胞内膜完整的条件下，选择性地部分破坏细胞外膜和细胞壁，使蛋白最大限度释放出来，而胞内物质尽量不受影响地存在于细胞内。本实验采用的渗透休克法是针对大肠杆菌的特点而设计的周质蛋白定向释放技术，大肠杆菌是细胞壁较脆弱的G^-菌，外膜主要组成为脂多糖，脂多糖具有吸附金属阳离子如Ca²⁺、Mg²⁺等作用。该方法首先将大肠杆菌置于含有EDTA的高渗蔗糖介质中，在高渗环境中细胞内水分外流，导致细胞收缩，同时利用EDTA螯合阳离子的能力，螯合吸附在外膜脂多糖表面上的金属阳离子，使细胞外膜受损，然后将收缩的细胞置入低渗的环境中，由于渗透压的急剧变化，细胞形态发生变化，细胞吸水膨胀，细胞周质空间也急剧膨胀，受损的外膜和细胞壁被部分撑破，通透性增加，周质空间的蛋白释放到胞外。若采用细胞完全破碎的抽提方法，细胞内容物全部释放，大量的杂蛋白与目的蛋白混杂在一起，增加了后续纯化的困难，最终将影响目的蛋白的提取率，此外，大量的杂蛋白中可能含有的蛋白酶或其他的抑制剂，对目的蛋白的提取也有影响。采用激烈的细胞破碎方法，如实验室常用的超声破碎法和工业生产中常用的机械破碎法还会对目的蛋白的活性存在一定的破坏作用，如引起部分目的酶的失活等。

本实验对在大肠杆菌周质空间表达的GST-Tαl-TP5融合蛋白的渗透休克提取法进行了优化，优化后的提取条件是高渗液为pH9.0，100mM Tris-HCl含10mM EDTA和20%的蔗糖，低渗液为20 mM Tris-HCl，pH 8.0，低渗提取时间为20 min。采用渗透休克法不需要复杂的设备和操作成本，规模可大可小，适用范围广，不仅为实现重组胸腺肽的大规模生产提供了新的技术支撑，对其他表达于细胞周质的重组蛋白的提取也起一定的借鉴作用。