EIF2AK2和NLRP3相互作用影响细胞分泌IL-1β的研究

鞠小丽，王 强



EIF2AK2和NLRP3相互作用影响细胞分泌IL-1β的研究

鞠小丽1，王 强2

目的 研究真核细胞翻译起始因子2AK2(EIF2AK2)蛋白对Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症体激活及细胞分泌IL-1β的影响。方法 在HEK-293细胞中，通过转染凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和促白细胞介素-1β(pro-IL-1β)基因构建NLRP3炎症体，并检测EIF2AK2蛋白过表达对细胞分泌炎症性细胞因子IL-1β的影响；通过免疫共沉淀研究EIF2AK2蛋白和NLRP3蛋白相互作用。最后在人单核THP-1细胞中通过siRNA干扰验证EIF2AK2对IL-1β分泌水平的影响。结果 在HEK-293细胞中，过表达EIF2AK2蛋白能激活NLRP3炎症体后诱导细胞分泌IL-1β，并且IL-1β分泌水平随EIF2AK2表达水平提高而增加。免疫共沉淀结果显示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白发生相互作用。THP-1细胞中siRNA干扰抑制EIF2AK2表达后发现细胞分泌IL-1β减少。结论 EIF2AK2蛋白能调控NLRP3炎症体的激活从而影响细胞分泌促炎症因子IL-1β。

NLRP3炎症体; EIF2AK2; IL-1β分泌; 蛋白相互作用

先天免疫系统通过各种模式识别相关分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)识别各种病原体后抵抗病原体入侵[1]。炎症体是一种由模式识别相关分子组成的大分子复合物。Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎症体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-containing aspartate-specific proteases-1，caspase-1)组成的分子量约为700 ku的大分子复合物[2-3]。目前研究[4]显示多种PAMP如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、单钠尿酸盐晶体(monosodium urate,MSU)、 胆固醇结晶、 β淀粉样蛋白等内源性危险信号都能引起 NLRP3炎症体的激活。NLRP3炎症体异常激活参与多种代谢异常疾病如Ⅱ型糖尿病、阿尔茨海默病和动脉粥样硬化等[5]。NLRP3炎症体激活3种模型：线粒体 DNA 假说、活性氧假说和溶酶体破裂假说[4]。已报道SGT1和Hsp90[6]、TXNIP、TRIM30[7]和GPSM3等蛋白能和NLRP3相互作用从而调节NLRP3炎症体激活。真核细胞翻译起始因子2AK2(eukaryotic translation initiation factors 2AK2, EIF2AK2)最初发现是一个病原识别分子, 该蛋白N末端能和双链RNA结合诱导C末端催化区域活化[8]。该研究通过在HEK-293细胞中重构NLRP3炎症体研究EIF2AK2在NLRP3炎症体激活中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人胚肾细胞HEK-293和人单核细胞 THP-1购自美国菌种保藏中心(ATCC)；DMEM和RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；人IL-1β ELISA 试剂盒购自美国BD公司；MSU和ATP购自美国Sigma公司；HA和Flag抗体购自美国CST公司; 二抗购自美国Invitrogen公司。

1.2 NLRP3炎症体在HEK-293细胞中构建 通过基因特异性引物分别从人的cDNA中扩增ASC、 NLRP3、 Caspase-1和促白细胞介素-1β(pro-interleukin-1β, pro-IL-1β)基因并克隆到pMD18-T载体上。随后分别用BamHⅠ和XhoⅠ进行酶切后连接到用相同酶切的真核表达载体pcDNA3，分别得到pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β重组体。按1×105个细胞/孔将细胞接种于24孔培养板中，每孔加入500 μl培养基培养过夜。 第2天分别将10 ng pcDNA3-ASC、20 ng pcDNA3-NLRP3、 5 ng pcDNA3-Caspase-1和100 ng pcDNA3-pro-IL-1β重组体通过X-tremeGENE HP共转染HEK-293细胞。转染后24 h分别收集的上清液，通过ELISA法检测HEK-293细胞分泌IL-1β水平。在研究EIF2AK2对IL-1β分泌影响实验中，除了按上面将pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β共转染HEK-293细胞外，还将25～200 ng的pcDNA3-HA-EIF2AK2的共转染HEK-293细胞，转染后 24 h分别收集细胞上清液并检测HEK-293细胞分泌IL-1β水平。

1.3 免疫沉淀反应 将克隆到pMD18-T载体的EIF2AK2和NLRP3基因分别通过BamH I和Xho I位点克隆到pEAK-HA和pCMV-Tag 2，随后克隆到pcDNA3上形成含HA标签的pcDNA3-HA-EIF2AK2重组体和Flag标签的cDNA3-Flag-NLRP3重组体。按1×106个细胞/孔将细胞接种于6孔培养板中，每孔加入2 ml培养基培养过夜。将pcDNA3-HA-EIF2AK2和pcDNA3-Flag-NLRP3重组体共转染细胞。转染 48 h后收集细胞，用预冷的PBS液冲洗细胞2遍后，用1 ml 含1% NP-40的细胞裂解液在冰上裂解细胞30 min。收集细胞上清液后加入1 μg小鼠抗 Flag单克隆抗体,4 ℃旋转混合2 h , 加入 20 μl蛋白A继续混合过夜, 离心后去上清液, 用细胞裂解液洗涤沉淀 3遍, 加入 20 μl的SDS-PAGE上样缓冲液, 煮沸 5 min,进行SDS-PAGE电泳。

1.4 Western blot法检测 细胞经RIPA裂解液裂解后收集上清液获得细胞总蛋白，并通过BCA方法进行蛋白定量。将20 μl蛋白样品上样后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后用半干电转仪转膜, 5%脱脂奶粉封闭 1 h , 然后加入1 ∶2 000稀释的兔抗 HA 多克隆抗体,4 ℃孵育过夜, 用 0.5% TBST洗膜3次, 加入 1 ∶10 000稀释的羊抗兔二抗, 室温孵育1 h,用0.5% TBST洗膜3次, 按照操作说明, 加入化学发光液, 进行凝胶成像显影。

1.5 siRNA干扰EIF2AK2及对IL-1β的分泌 根据人的EIF2AK2基因序列，按照siRNA 的设计原则分别设计两对siRNA(正义引物: 5′-CAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAA-3′; 反义引物: 5′- GGACCTCCACATGATAGGAGGTTTA- 3′)，并交由美国Invitrogen公司合成。按1×106个细胞/孔将细胞接种于24孔培养板中，每孔加入500 μl培养基。将20 mol/L的siRNA 用Invitrogen细胞电转仪Neon Transfection System(MPK5000)进行转染。转染48 h后，收集细胞并提取RNA进行半定量PCR检测EIF2AK2表达水平。同时将5×104个细胞/孔将细胞接种于96孔培养板中，分别用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L的ATP刺激6 h和3 h后，收集细胞上清液，通过ELISA法检测细胞分泌IL-1β水平。

2 结果

2.1 HEK-293细胞中过表达EIF2AK2诱导细胞分泌IL-1β Western blot结果显示EIF2AK2能在HEK-293细胞中过表达(图1A)。将10 ng ASC、20 ng NLRP3、5 ng Caspase-1和100 ng pro-IL-1β共转染HEK-293细胞24 h后，ELISA结果显示炎症体复合物能诱导IL-1β分泌(图1B)。为了研究EIF2AK2是否影响NLRP3炎症体激活和IL-1β的分泌，将 EIF2AK2、 ASC、NLRP3、 Caspase-1和pro-IL-1β共转染HEK-293细胞，结果显示EIF2AK2能显著诱导细胞分泌IL-1β(图1B)。

2.2 EIF2AK2促进IL-1β分泌具有浓度依赖性 将0～100 ng 的EIF2AK2和NLRP3炎症体复合物共转染HEK-293细胞24 h后，Western blot结果显示EIF2AK2表达水平随着转染pcDNA3-HA-EIF2AK2重组体的量增加而增加(图2A)。 ELISA检测显示25～100 ng的EIF2AK2能促进细胞分泌IL-1β，并且细胞分泌IL-1β水平随着EIF2AK2浓度的增加而增加(图2B)。

2.3 EIF2AK2和NLRP3蛋白相互作用 将Flag标签的NLRP3蛋白和HA标签的EIF2AK2蛋白共转染HEK-293细胞，通过免疫共沉淀显示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白发生相互作用(图3)。而对照IgG并未检测到条带，说明EIF2AK2和NLRP3发生特异的相互作用。

图1 HEK-293细胞过表达EIF2AK2对IL-1β分泌影响

A：Western blot法检测EIF2AK2表达水平；B：ELISA法检测IL-1β分泌水平；1：空载体；2：pcDNA3-HA-EIF2AK2

图2 HEK-293细胞中EIF2AK2蛋白表达水平对IL-1β分泌的影响

A：Western blot法检测EIF2AK2表达水平；B: ELISA法检测IL-1β分泌水平；1～4：细胞分别转染0、25、50、100 ng pcDNA3-HA-EIF2AK2载体

图3 HEK-293细胞中EIF2AK2和NLRP3免疫共沉淀结果

2.4 siRNA干扰EIF2AK2表达后抑制IL-1β的分泌 在人单核THP-1细胞中分别转染EIF2AK2(#1和#2)和对照siRNA，转染48 h后RT-PCR结果显示EIF2AK2基因表达水平被显著抑制(图4A)。将这些细胞分别用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L 的ATP刺激6 h和3 h后， EIF2AK2干扰的THP-1细胞比对照细胞分泌的IL-1β明显减少(图4)。

图4 THP-1细胞中siRNA干扰EIF2AK2后RT-PCR检测基因表达水平(A)及ELISA法检测IL-1β分泌水平(B)

1：对照siRNA；2：siRNA EIF2AK2#1；3：siRNA EIF2AK2#2

3 讨论

NLRP3炎症体激活是一个复杂的过程，涉及到一系列事件。不同的微生物和代谢产物激活NLRP3炎症体的机制也不同[4]。如尿酸钠晶体和二氧化硅通过钙离子外流激活NLRP3炎症体[9-10]， 胰岛淀粉样多肽则通过活性氧激活NLRP3炎症体[11]，而β淀粉样蛋白则通过溶酶体破裂激活炎症体[12]。目前还没有发现NLRP3能直接识别这些配体而激活炎症体。推测可能通过不同上游信号激活NLRP3炎症体，因此研究调节NLRP3炎症体激活的蛋白具有重要意义。目前已发现两类调节NLRP3炎症体的蛋白。一类包括热蛋白、POP 和病毒热蛋白(vPYDs)等具有PYD结构域的蛋白；另一类为包括 Iceberg、COP1、INCA和 Caspase-12 等含有CARD结构域的蛋白。本研究中显示的负调节蛋白虽然不含有这两个结构域，但已有的研究[13]显示EIF2AK2是一个病原识别受体，该蛋白的N末端能和双链RNA病毒相结合后激活C末端催化区域。同时亦显示该蛋白N末端还能识别许多非病毒类刺激，如脂肪酸、细胞外ATP和二氧化硅晶体等[13]。本研究显示在THP-1细胞中，抑制EIF2AK2表达后能促进ATP诱导的THP-1细胞中IL-1β分泌，推测ATP可能通过激活EIF2AK2从而影响炎症激活，最终影响细胞分泌IL-1β。具体的机制将在以后的研究中进一步验证。

NLRP3炎症体由NLRP3蛋白、接头蛋白ASC和效应蛋白 Caspase-1 组成复合体。本研究显示EIF2AK2蛋白能和炎症体的NLRP3蛋白相互作用，然而并不清楚该蛋白是否和炎症体中其它蛋白如ASC等相互作用，今后的研究方向将会进一步研究该蛋白调节炎症体激活的具体机制。NLRP3 炎症体和一系列的代谢疾病有关，虽然对NLRP3炎症体激活有了较多的认识，但针对NLRP3炎症体仍有许多问题需要研究解决，其中重要的问题之一就是炎症体如何被精确的调控，本研究显示EIF2AK2蛋白能调节NLRP3炎症体将为炎症体相关的疾病预防提供新的思路。

[1] Girardin S E,Philpott D J. Mini-review: the role of peptidoglycan recognition in innate immunity[J]. Eur J Immuno, 2004, 34(7):1777-82.

[2] Lamkanfi M, Dixit V M. Mechanisms and functions of inflammasomes[J]. Cell, 2014, 57(5):1013-22.

[3] Davis B K, Wen H,Ting J P. The inflammasome NLRs in immunity, inflammation, and associated diseases[J]. Annu Rev Immuno, 2011, 29:707-35.

[4] Tschopp J,Schroder K. NLRP3 inflammasome activation: The convergence of multiple signalling pathways on ROS production[J]. Nat Rev Immuno, 2010, 10(3):210-5.

[5] De Nardo D, Latz E. NLRP3 inflammasomes link inflammation and metabolic disease[J]. Trends Immuno, 2011, 32(8):373-9.

[6] Mayor A, Martinon F, De Smedt T, et al. A crucial function of SGT1 and HSP90 in inflammasome activity links mammalian and plant innate immune responses[J]. Nat Immunol, 2007, 8(5):497-503.

[7] Hu Y, Mao K, Zeng Y, et al. Tripartite-motif protein 30 negatively regulates NLRP3 inflammasome activation by modulating reactive oxygen species production[J].Immunol, 2010, 185(12):7699-705.

[8] Bullido M J, Martinez-Garcia A, Tenorio R, et al. Double stranded RNA activated EIF2 alpha kinase (EIF2AK2; PKR) is associated with Alzheimer′s disease[J]. Neurobiol Aging, 2008, 29(8):1160-6.

[9] Martinon F, Petrilli V, Mayor A T, et al. Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inflammasome[J]. Nature, 2006, 440(7081):237-41.

[10]Cassel S L, Eisenbarth S C, Iyer S S, et al. The Nalp3 inflammasome is essential for the development of silicosis[J]. P Natl Acad Sci USA,2008, 105(26):9035-40.

[11]Westermark P, Andersson A,Westermark G T. Islet amyloid polypeptide, islet amyloid, and diabetes mellitus[J]. Physiol Rev, 2011, 91(3):795-826.

[12]Halle A, Hornung V, Petzold G C, et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta[J]. Nat Immunol, 2008 , 9(8):857-65.

[13]Niso-Santano M, Shen S, Adjemian S, et al. Direct interaction between STAT3 and EIF2AK2 controls fatty acid-induced autophagy[J].Autophagy, 2013, 9(3):415-7.

Investigation of EIF2AK2 interaction with NLRP3 and effect on the release of IL-1β

Ju Xiaoli1,Wang Qiang2

(1SchoolofMedicine,2InstituteofLifeSciences,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofEIF2AK2ontheactivationofNLRP3inflammasomeandthereleaseofIL-1β.MethodsNLRP3inflammasomewasre-constructedinHEK-293cellstoexaminethereleaseofIL-1βbyoverexpressionofEIF2AK2.Theco-immunoprecipitationwasperformedtoinvestigatetheinteractionbetweenEIF2AK2andNLRP3.FinallysiRNAofEIF2AK2inTHP-1cellswasperformedtoexaminethereleaseofIL-1β.ResultsOverexpressionofEIF2AK2inHEK-293cellsactivatedNLRP3inflammasomeandincreasedIL-1βrelease.IL-1βreleaseincreasedgreatlywhenexpressionlevelofEIF2AK2increased.Theco-immunoprecipitationresultsdemonstratedthatEIF2AK2interactedwithNLRP3inHEK-293cells.IL-1βreleasewasreducedwhenEIF2AK2expressionwasinhibitedbysiRNAinTHP-1cells.ConclusionTheseresultssuggestthatEIF2AK2regulatestheactivationofNLRP3inflammasomeandthenaffectsIL-1βrelease.

NLRP3inflammasome;EIF2AK2;IL-1βrelease;proteininteraction

国家自然科学基金(编号：81502621、81502088)，江苏省自然科学基金(编号：BK20140539)，江苏大学高级人才启动基金项目((编号：14JDG065、15JDG021)，中国博士后科学基金(编号：2015M571677)

江苏大学1医学院病理教研室、2生命科学研究院，镇江 212013

鞠小丽，女，讲师； 王 强，男，助理研究员，硕士生导师，责任作者，wanqqiang@ujs.edu.cn

时间：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.003.html

R 392.11

A

1000-1492(2016)11-1565-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.003

2016-06-12接收