基于LC-MS的紫娟烘青绿茶加工过程中花青素变化规律研究

解东超，戴伟东，李朋亮，谭俊峰，林智

1. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

基于LC-MS的紫娟烘青绿茶加工过程中花青素变化规律研究

解东超1,2，戴伟东1*，李朋亮1，谭俊峰1，林智1*

1. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

优化建立了紫娟烘青绿茶中花青素的酸性乙醇提取方法和14种花青素组分的高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）分析方法，并进一步对烘青绿茶加工过程中花青素组分的变化进行了定量分析。结果显示：在紫娟烘青绿茶中，共检测到9种花青素成分：飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素、飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷，其中飞燕草类花青素和矢车菊类花青素为紫娟花青素的主要成分。紫娟鲜叶中花青素总量为4.64mg·g-1，经摊放、杀青、揉捻、毛火干燥、足火干燥处理的茶样中花青素总量呈下降趋势，含量分别为4.83、3.74、3.70、2.83、1.82mg·g-1。高温处理是导致花青素下降的最主要因素，其中矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷的下降最为明显。

紫娟；烘青绿茶；花青素；液相色谱质谱联用；加工过程

花青素作为广泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，其生理功效一直是研究的热点[1]。自然情况下，植物体内花青素通常以低聚花青素和花色苷的形式存在。花青素的基本母核结构是2-苯基苯并吡喃[2]，具有类黄酮的典型结构。研究表明花青素具有抗氧化、清除自由基、降血压、抗肿瘤、抗衰老、改善视力、预防糖尿病、预防心血管疾病等作用[3-11]。花青素以其天然、安全、来源丰富等优势作为添加剂广泛应用于食品、动植物饲料和化妆品等行业[12]。

茶叶作为受大众欢迎的世界性饮品，其保健功能早已深入人心。一些茶树因自身基因和环境影响，出现紫芽红叶现象[13]，其具有含量较高的花青素而日益受到研究者的关注。因花青素种类繁多、易被氧化、且在不同pH值条件下呈现不同的结构，给其定性定量研究带来了较大困难。高效液相色谱、质谱、核磁等方式是目前花青素组分的主要分析手段[14]。但是目前不同的紫芽茶报道之间，花青素组分及含量差异较大，如Mari Maeda-Yamamoto等[15]采用高效液相色谱和核磁共振对日本紫芽茶品种（cv. Sunrouge）进行研究，共鉴定出10种花青素组分，全部为花青素的糖苷形式，花青素平均总含量为3.09mg·g-1。L.C. Kerio等[16]从肯尼亚当地紫芽茶TRFK306等品种中共鉴定出7中花青素组分，且花青素组成与日本研究者[15]有较大差异，其花青素含量为1.99mg·g-1。我国作为茶叶的故乡，紫芽茶种类繁多，本实验选用的紫娟品种是由云南大叶群体种勐海大叶茶单株培育而成，其芽、叶、茎均为紫色，花萼、花梗呈浅紫色，果皮微紫，比一般紫芽茶花青素高1～3倍[17]。龚加顺等[18]分离鉴定出紫娟晒青中14种花色苷，其中花青素占10种，原花青素4种，具体含量并未测定；李智等[19]对紫娟蒸青茶的分析推测出5种花青素组分。Jiang等[20]在紫娟鲜叶中分离鉴定出4种主要的花青素成分，花青素总量为0.707mg·g-1。相比较于红茶、乌龙茶等加工工艺，绿茶加工工艺可以最大限度地保留茶叶中花青素成分[21]。因此，本研究针对紫娟茶花青素研究结果差异较大，且加工过程中花青素组成及含量变化研究较少的现象，优化建立了适用于HPLC-MS的茶叶中花青素前处理及分析方法，并应用此方法测定了紫娟烘青绿茶加工过程中花青素组分的含量变化规律，研究结果对于紫芽茶花青素的研究与利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1实验材料与仪器

试剂：95%乙醇、浓盐酸、甲酸（杭州龙山精细化有限公司）均为分析纯，Milli-Q超纯水，乙腈（德国默克公司），12种花青素标样（表1）购自美国Sigma公司和武汉天植生物技术有限公司，Bond Elut C18SPE柱（500 mg，6mL，安捷伦公司）。

仪器：6CST-40滚筒杀青机（浙江上洋机械有限公司）、6CR-30名茶揉捻机（天茗机械有限公司）、6CTH-6型名茶提香机（珠峰机械有限公司）、IKA磨样器、KQ3200E超声波清洗仪（昆山超声波仪器厂）、Centrifuge 5180R高速离心机（Eppendorf公司）、RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、AB104-S分析天平（Mettler Toledo公司）。

表1　12种花青素的LC-MS信息及标准曲线Table 1 LC-MS analysis of 12 anthocyanins and their calibration curves

1.2实验方法

1.2.1紫娟烘青绿茶及其过程样制作

紫娟烘青绿茶（2015年10月）制作于云南省农业科学院茶叶研究所。制作流程为：紫娟鲜叶（一芽二叶）→摊放（2 h左右）→滚筒杀青（340℃，90 s）→揉捻（30min）→毛火干燥（110℃，15min）→足火干燥（90℃，40min）。按照此流程重复制作茶样3份，每个过程取样100g，冷冻干燥备用。

1.2.2样品前处理

紫娟烘青各过程冻干样经IKA磨样器磨成茶粉（过100目筛）。目前文献报道的茶叶中花青素提取方法多种多样[15-16,20,22-23]，为了对紫娟中花青素尽可能提取完全，本实验设置了如下6种前处理方法进行比较。

处理1：准确称量200 mg紫娟烘青绿茶茶粉，加入9mL 40%甲醇（含0.05% TFA），超声波（40 kHz，37℃条件下持续20min）辅助提取，室温条件下离心（8 000 r·min-1，10min）取上清液，沉淀的茶粉继续以8mL 40%甲醇（含0.05% TFA）提取2次，合并上清液约25mL，于45℃条件下旋转蒸发，用3%甲醇溶液定容至5mL，过SPE柱净化，用2mL 0.1%盐酸水溶液复溶，过0.45μm滤膜后进行HPLC-MS分析。

处理2：在处理1的基础上进行，即复溶后，进一步取1mL待测液，用2mL三氯甲烷、3mL乙酸乙酯进行萃取后取水层进样分析。

处理3：准确称取200 mg紫娟烘青绿茶茶粉，加入10mL 15%乙酸，静置于4℃条件下过夜提取，离心（8 000 r·min-1，10min）取上清液约10mL，于45℃条件下旋转蒸发，用3%甲醇定容至5mL，过SPE柱净化，用2mL 0.1%盐酸水溶液复溶，过0.45μm滤膜后进行HPLC-MS分析。

处理4：在处理3的基础上进行，即复溶后，进一步取1mL待测液，用2mL三氯甲烷、3mL乙酸乙酯进行萃取后取水层进样分析。

处理5：准确称取200 mg紫娟烘青绿茶茶粉，加入10mL 20%酸性乙醇（含0.1%盐酸），超声波辅助提取（40 kHz，室温条件下持续20min），离心（8 000 r·min-1，10min）收集上清液，沉淀的茶粉按照提取流程重复2次，合并上清液约30mL，于45℃条件下旋转蒸发，用3%甲醇定容至5mL，过SPE柱净化，用2mL 0.1%盐酸水溶液复溶，过0.45μm滤膜后进行HPLC-MS分析。

处理6：在处理5的基础上进行，即复溶后，进一步取1mL待测液，用2mL三氯甲烷、3mL乙酸乙酯进行萃取后取水层进样分析。

以上过程中SPE流程如下：SPE柱先用10mL纯甲醇活化，再用10mL超纯水平衡，待上样后用5mL 3%甲醇溶液淋洗去除强极性化合物，再用15mL 60%甲醇洗脱花青素，收集溶液旋干。

1.2.3花青素HPLC-MS分析

液相色谱分析条件：Agilent 1100液相色谱仪串联离子阱质谱联用仪；Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.7μm，Waters公司）；流动相A相为0.1%甲酸溶液，B相为100%乙腈；进样量为5μL；流速为0.3mL·min-1；柱温为40℃。流动相线性梯度洗脱为：0min：5%B；30min：15%B；31min：45%B； 33min：50%B；34min：5%B；45min：5%B。

质谱分析条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正离子模式；扫描范围：m/z 200～650；干燥气体（N2）流速为12 L·min-1；干燥气温度为350℃；喷雾气压为206.85 kPa；毛细管电压：3 500 V。

1.2.4花青素标准曲线制作

12种花青素标样的质量浓度为1 mg·mL-1，用0.1%盐酸水溶液稀释配制成浓度1、2、3、4、5、6、7、8 μg·mL-1的混标溶液。

1.2.5数据处理

实验中数据分析采用SPSS 18.0软件中Tukey s-b(K)进行统计学差异分析，采用Smica-P 11.5软件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1紫娟中花青素组分鉴定

图1　12种花青素标样LC-MS分析提取离子流色谱图Fig. 1 Extracted ion chromatography (EIC) of 12 anthocyanin standards

12种花青素混标溶液按照“1.2.3”进样分析，在C18色谱柱上得到良好分离（图1），其保留时间和准分子离子峰质荷比如表1所示。通过比对保留时间和质荷比，在紫娟鲜叶冻干茶样中可以检测到其中的7种花青素，分别为飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素。其中含量较高的为飞燕草-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷。在1～8 μg·mL-1线性范围内，标准曲线见表1，相关系数r为0.9819～0.9981，线性良好。与大部分文献仅采用1个标样（矢车菊素-3-O-半乳糖苷或者矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）作为定量依据相比，本研究共采用12种花青素标样，制作了12条标准曲线，在定量的准确性上具有优势。

除了这12种可以购买到标准品的花青素外，我们还进一步对文献[15,20]中报道的另外两种含量较高的花青素（飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷）进行了LC-MS峰提取，发现在保留时间为23.4min和25.3min的位置可分别检测到质荷比为611.4和595.4的色谱峰。进一步采用高分辨质谱（UPLC-QTOF/MS, Xevo G2-S, Waters公司）对其精确分子量进行了测定，质荷比分别为611.1392和595.1417，与文献报道的飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷相符合（与理论质荷比偏差分别为－0.5×10-6和－4.9×10-6），且在其他普通绿茶样品中检测不到，因此推断这两个峰分别为飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷。由于这两种花青素成分无相应标准品，则选用化学结构最为接近的飞燕草-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷的标准曲线作为定量依据。综上所述，在紫娟茶中共发现并鉴定了9种花青素成分。

2.2不同前处理方式对花青素提取效果比较

花青素化学性质并不稳定，且不同的花青素组分的极性相差较大[24]，目前文献报道的花青素提取方法也不尽相同，这可能是导致最终花青素定量结果相差较大的原因之一。因此本实验比较了6种文献报道的茶叶中花青素提取方法，希望阐明这些方法对于花青素定量分析的影响，并从中选出一种适合于花青素LC-MS分析的样品前处理方法。

结果发现不同的前处理方式对花青素的提取效果影响较大（表2）。对紫娟烘青绿茶成品茶样品，处理1的茶样中检测到6种花青素成分，花青素总量为2.21mg·g-1；处理2检测到4种花青素成分，总量为0.95mg·g-1；处理3检测到5种花青素成分，总量为1.77mg·g-1；处理4检测到5种花青素成分，总量为0.66mg·g-1；处理5检测到8种花青素成分，总量为1.96mg·g-1；处理6检测到5种花青素成分，总量为1.06mg·g-1。处理1和处理5对于茶叶中花青素的提取效率最高（检测到的花青素总量最高），处理5提取检测到最多种类的花青素成分。综合考虑茶叶中花青素检测的种类和总量，选取处理5作为紫娟茶中花青素LC-MS分析的前处理方法。

2.3紫娟烘青加工过程中花青素组分及含量变化

如图2所示，在紫娟鲜叶中共检测到9种花青素组分，按照保留时间先后顺序依次为飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、飞燕草色素、矢车菊色素、天竺葵色素、芍药素、飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷。这9种花青素在紫娟鲜叶冻干样、摊放后冻干样、杀青后冻干样、揉捻后冻干样、毛火干燥后冻干样、足火后冻干样中测得的组成和含量如表3所示。

在加工过程中，紫娟烘青绿茶花青素主成分分析的整体变化如图3-A所示，杀青、毛火干燥和足火干燥过程中花青素发生明显变化，而摊放和揉捻过程并未明显改变其花青素轮廓。相应的主成分分析载荷图（图3-B）表明在紫娟烘青绿茶加工过程中，变化最为明显的花青素主要有3种，分别为矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷。

表2　不同前处理方式对于紫娟茶花青素组分及含量的影响Table 2 The effects of different treatments on anthocyanin compositions and contents (mg·g-1) in ‘Zijuan’ tea

表3　紫娟茶加工过程中花青素组成及含量变化Table 3 Changes of anthocyanins during the manufacturing process of ‘Zijuan’ tea

2.3.1紫娟鲜叶花青素组成及含量

表3显示，紫娟鲜叶的花青素总量3次取样的平均值为4.64mg·g-1，其中飞燕草-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷含量最高，为1.67mg·g-1，占总花青素的35.99%；其次为矢车菊素-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷，含量为1.47mg·g-1，飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O- 半乳糖苷含量分别为0.56mg·g-1和0.85mg·g-1，说明花青素在紫娟鲜叶中主要是飞燕草色素和矢车菊素的糖苷类物质，这4种花青素成分占测定的紫娟鲜叶中总花青素含量的98.06%。

2.3.2紫娟摊放过程中花青素含量变化

摊放样品相较茶鲜叶中花青素总量成分变化不明显。3次平行实验的平均结果表明花青素总量略有增加，但无统计学显著性差异（P＞0.05）。相比较于鲜叶中花青素含量，含量较高的四种花青素：飞燕草-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷略微下降，而飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷稍有增加，这可能是由于茶叶在摊放过程中水分的散失导致花青素成分发生了轻微变化（表3）。

图2　紫娟鲜叶提取物中9种花青素的HPLC-MS提取离子流色谱图Fig. 2 Extracted 9 anthocyanins ion chromatogram from ‘Zijuan’ leaves by HPLC-MS

图3　紫娟烘青茶加工过程中花青素变化主成分分析Fig. 3 PCA analysis of the changes of anthocyanins during the ‘Zijuan’green tea processing

2.3.3紫娟杀青过程中花青素含量变化

茶叶中花青素经杀青的短时高温，其含量较鲜叶和摊放过程发生明显变化。总量上较鲜叶冻干样和摊放后冻干样分别下降19.40%和22.56%。其中鲜叶中含有的矢车菊素已检测不到，飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷，矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷含量均有显著下降，而其他花青素组分含量变化不大（表3）。这也验证了不同的糖基类型对花色苷的稳定性影响亦不同[25]。

2.3.4紫娟揉捻过程中花青素含量变化

在杀青后的回潮揉捻过程中，茶叶部分细胞结构被破坏，从而导致茶叶细胞液流出，但该过程中细胞内的酶已经被钝化，温度、光照等环境因素在揉捻过程中变化程度亦相对较小，揉捻过程对花青素总量的变化不再如杀青过程中明显。经揉捻后，紫娟茶花青素总量为3.70mg·g-1，各花青素组分含量较杀青后冻干样变化不大（表3）。

2.3.5紫娟毛火过程中花青素含量变化

紫娟毛火干燥后花青素总量为2.83mg·g-1，相较之前工序发生明显变化，飞燕草-3-O-（6-香豆酰基）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰基）-半乳糖苷含量进一步下降（表3）。造成这种变化的主要原因是揉捻后的茶叶经过了持续15min的高温（110℃）干燥。这进一步表明高温对于花青素影响较大，相对时长较长的高温下，花青素进一步发生了降解。

2.3.6紫娟足火过程中花青素含量变化

紫娟茶中花青素含量在足火干燥后，较之前的毛火干燥过程样具有显著差异，矢车菊素的糖苷类花青素（矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷）含量进一步明显下降。最终获得的紫娟成品茶中花青素总量为1.82mg·g-1，较鲜叶下降60.78%，其中飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷损失率最大，分别下降55.69%、78.91%和80.00%。

3 讨论

紫芽茶内花青素成分在加工过程中的变化目前鲜有报道。本研究优化建立了茶叶中花青素的提取方法和LC-MS分析方法，可对茶叶中14种主要花青素成分进行定性定量分析。并将该方法成功应用于紫娟花青素在烘青绿茶加工过程中的变化规律研究。结果表明，紫娟鲜叶中主要存在9种花青素成分，总量为4.64mg·g-1，多以糖苷形式存在，其中飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷为主要成分，占花青素总量的98.06%。在紫娟烘青加工过程中主要的花青素糖苷含量呈下降趋势，从而导致成品茶中花青素总量明显下降，最终测定的紫娟烘青绿茶成品茶的花青素总量为1.82mg·g-1，相较于鲜叶中花青素损失率为60.78%。绿茶加工中的杀青、毛火干燥、足火干燥过程中，花青素含量的变化最为剧烈，摊放和揉捻过程对花青素含量影响不大，表明高温处理是造成紫娟茶花青素降低的最主要因素，导致含量较高、结构较复杂的糖苷类花青素分解。

本实验中，采用HPLC-MS定性定量紫娟茶中花青素，并对紫娟烘青加工过程中花青素成分及含量变化进行了研究。该结果对于了解紫娟茶的特征成分，以及花青素在茶叶加工过程中的变化规律具有重要意义，对于紫芽茶加工生产亦具有指导意义。在今后工作中，将进一步研究其他茶叶加工工艺（如红茶加工工艺、白茶加工工艺）对花青素组成和含量的影响，并探讨加工过程中花青素成分的转化产物，进而为紫芽茶的开发利用提供理论基础。

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Study on the Compositions and Dynamic Changes of Anthocyanins during the Manufacturing Process of‘Zijuan’ Baked Green Tea

XIE Dongchao1,2, DAI Weidong1*, LI Pengliang1, TAN Junfeng1, LIN Zhi1*
1. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

High performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS) analysis of 14 anthocyanins from ‘Zijuan’ bakedgreen tea was established, and successfully applied to analyze the dynamic changes of anthocyanins during the manufacturing process. Acidic ethanol was used to extract anthocyanins. Nine anthocyanins, including delphinidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-galactoside, pelargonidin-3-O-glucoside, cyanidin, pelargonidin, delphinidin, peonidin, delphinidin-3-O-(6-coumaroyl)-galactoside, and cyanidin-3-O-(6-coumaroyl)-galactoside, were detected in ‘Zijuan’ bakedgreen teas. Among them, delphinidin-3-O-galactoside, cyanidin-3-O-galactoside, delphinidin-3- O-(6-coumaroyl)-galactoside, and cyanidin-3-O-(6-coumaroyl)-galactoside were the major anthocyanin components in ‘Zijuan’. The total anthocyanin contentgenerally declined during the manufacturing process, with its peak at 4.83mg·g-1after withering and bottem at 1.82mg·g-1in the final drying process. High temperature treatment was the key factor for the decline of anthocyanins. While, cyanidin-3-O-galactoside, delphinidin-3-O-(6-coumaroyl)-galactoside, and cyanidin-3-O-(6-coumaroyl)-galactoside were easily affected during that process.

Zijuan, bakedgreen tea, anthocyanin, liquid chromatography-mass spectrometry, manufacturing process

TS272.5+1；TS272.5+5

A

1000-369X（2016）06-603-10

2016-08-02

2016-09-20

国家自然科学基金（31500561）、中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）、现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-23）。

解东超，男，硕士研究生，主要从事茶叶加工品质化学研究。*通讯作者：linzhi@caas.cn