戊炔草胺(propyzamide)作用于刺葡萄的倍性诱变研究

2016-12-19 19:20蔡冬元林继华邓建平
中南林业科技大学学报 2016年7期
关键词:草胺秋水仙素枝蔓

蔡冬元,林继华,邓建平

(湖南生物机电职业技术学院,湖南 长沙 410127)

戊炔草胺(propyzamide)作用于刺葡萄的倍性诱变研究

蔡冬元,林继华,邓建平

(湖南生物机电职业技术学院,湖南 长沙 410127)

对照刺葡萄染色体数目为2n=2x=38[1-7],变异类型的染色体数目大多为2n→4x=76,少量为2n→2x=38+4、2n→2x=38+6;0.004%戊炔草胺处理对已萌发的刺葡萄种子浸渍24h有最佳倍性诱变效果,诱变率达41.7%;0.006%戊炔草胺处理套罩正处于生长状态的芽,倍性诱变效果最佳,诱变率达42.8%。不同浓度的戊炔草胺分别作用于刺葡萄已萌发种子与正处于生长状态的芽都有较好的倍性诱变效应。用戊炔草胺为倍性诱变试剂,诱导染色体发生倍性变异,为选育无籽或少籽、大粒、优质的刺葡萄新品系提供育种材料。

戊炔草胺;秋水仙素;刺葡萄;多倍体;诱变

刺葡萄V.davidii属东亚种群,2n=2x=38[1-7],是我国南方主要野生葡萄之一,主要分布在长江以南亚热带温湿雨林丛山中,能较好适应高温多湿气候条件,对葡萄常患病害白腐病、炭疽病、黑痘病等具有很好抗性,适应性强[1-6],这一独特表现为南方葡萄无公害化种植描绘了广阔前景,也为葡萄耐湿性砧木及新品种选育等提供了优秀资源与材料。刺葡萄的新蔓、嫩叶与果实色彩非常丰富,观赏效果与价值比普通葡萄更高,是公园、庭院等处优良垂直观赏绿化植物。大多数刺葡萄果粒的皮色为兰黑色或兰紫色,药用效果与价值比一般葡萄更显著,更利于人们身体健康[2-5]。与栽培于长江以南的其它葡萄相比,刺葡萄更适于葡萄的加工与酿酒,其附加产品更丰富,附加值更高[1-5]。因刺葡萄具有上述几方面独特表现,长江以南许多地方的农民已把野生刺葡萄家植化并获得了极大成功。

刺葡萄果粒较小,果内含较多种子。已有利用秋水仙素处理刺葡萄已萌动种子[6]和生长芽[7],诱导染色体加倍而成功获得刺葡萄多倍体(2n→4x=76)的研究报道[6-7]。但秋水仙素是一剧毒植物碱,操作过程中稍有不慎,即对处理对象和操作者带来极大危害。戊炔草胺(propyzamide;CAS:23950-58-5,分子式:C12H11Cl2NO;分子量256.13)又叫快敌蜱;拿草特;戊炔草胺;炔苯酰草胺;戊炔草胺标准品;戊炔草胺标准溶液等,当前生产上主要用于杂草的芽前除草[8-13]。它和秋水仙素一样,是一种抗微管物质,当它们与正在分裂的植物细胞接触后,能有效抑制微管的聚合过程,阻碍纺锤丝形成,从而诱使植物细胞核内染色体成功加倍[8-16]。近年来,国外已有将戊炔草胺作用于苹果、梨、猕猴桃等植物染色体,并成功使这些植物染色体加倍的报道,认为戊炔草胺是除秋水仙素外又一适合植物染色体加倍的化学试剂,与秋水仙素相比,戊炔草胺具有低毒性、低浓度、低成本、高效率诱导染色体加倍等特点[8-12],是一种新型的植物倍性诱变剂。现在国内外还没有将戊炔草胺运用于刺葡萄染色体并成功使其加倍的报道,本研究的意义是首次利用戊炔草胺(propyzamide)作用于已萌动的刺葡萄种子和即将萌动的刺葡萄芽,对其进行倍性诱导,为得到粒大优质,少籽或无籽的刺葡萄多倍体新类型与新品系提供倍性育种资源与材料。

1 材料与方法

试验于2013年9月至2015年10月在湖南生物机电职业技术学院藤本植物园、湖南生物机电职业技术学院生物技术中心进行。

1.1 戊炔草胺浸渍已萌发刺葡萄种子的倍性诱变试验

1.1.1 试材与戊炔草胺溶液的制备

2013年9月15日从湖南生物机电职院藤本园刺葡萄植株已成熟果穗上收集种子,清洗晾干后用洁净河沙层积贮藏。2014年3月5日,取5×300粒刺葡萄种子分别置于种子发芽盒,将发芽盒置于25℃恒温箱中催芽至露白。

配制戊炔草胺溶液:将戊炔草胺充分溶于二甲基亚砜(DMSO),用蒸馏水定容配制成浓度为0.05%的母液,后分别稀释配成浓度为0.003%、0.004%、0.005%戊炔草胺溶液各1 500 mL。后将已露白的刺葡萄种子浸渍其中。

1.1.2 处理方法

戊炔草胺作用于已萌发的刺葡萄种子的倍性诱变试验设计方案见表1:该试验以浸渍法进行。清水浸渍为对照,设3次重复,共12个处理;每发芽盒中盛装不同浓度的处理溶液500 mL,浸渍催芽效果相同或基本的已萌发露白刺葡萄种子100粒,浸渍时间分别为12、24、36 h。

种子浸渍试验在25 ℃恒温摇床(旋转频率:40~400 r/min;摆振幅度:Φ25 mm)中进行。

刺葡萄种子浸渍处理完成后,用清水洗净种子,分别播种于大棚内“0.618侧腰开孔”“黄金”营养钵中,统计成活率,观测刺葡萄生长发育情况与倍性诱变效果。

表1 戊炔草胺浸渍刺葡萄种子的倍性诱变试验设计Table 1 Experiment design of immersion of propyzamide concentration on Vitis davidii foex seed

1.2 戊炔草胺套罩处于生长状态的刺葡萄芽的倍性诱变试验

1.2.1 试材与戊炔草胺琼脂膏的制备

2014年3月21日,从刺葡萄植株上选取生长基本相同、有15个芽(多的侧芽抹除)、且已处于活动状态的枝蔓12条,为保证芽抽发后形成新梢的能力一致,需将选中的枝蔓拉平绑缚。

戊炔草胺琼脂膏的制备:将戊炔草胺配制成浓度为0.05%的母液,后分别稀释配成浓度为0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%的戊炔草胺溶液。将琼脂(10%)充分溶解至上述配制好的各戊炔草胺溶液与清水中,分别制成用防水胶囊盛装的各浓度戊炔草胺琼脂膏与清水对照琼脂膏。

1.2.2 处理方法

该试验以套罩法进行。以清水琼脂膏套罩为对照,5个处理;每处理套罩已选定、并已拉平绑缚的2条刺葡萄枝蔓上的芽2×15=30个,用黑色胶布固定防水胶囊。

套罩6 d后,去掉胶囊,用清水洗净粘附于芽与枝蔓上的琼脂,后随新梢的抽发,叶与枝蔓的形成,仔细观测各处理对叶片、枝蔓、果等组织器官生长发育影响与倍性诱变效果。

1.3 观测内容与测定方法

1.3.1 茎尖、茎段染色体观测方法

采用去壁低渗法和Giemsa(吉姆萨)染色法展开镜检与染色体数目观测试验。晴天上午8∶30~10∶00→分别从对照与经戊炔草胺药剂浸渍法和套罩法处理的刺葡萄植株与新抽发的新蔓上→取长度为1 cm的幼嫩茎尖或茎段→浸入0.002 mol/L 8-羟基喹啉液2 h→吸出药液→添入0.075 mol/L KCl溶液→置于20℃温度条件下浸泡20 min→25℃温度条件下,用25%等份纤维素酶和果胶酶(混合酶液)酶解2~3 h→用蒸馏水冲洗2~3次后,置入蒸馏水中浸泡20 min→于现配的3∶1甲醇冰醋酸固定液中固定→取出,将材料捣碎,去除肉眼所见杂质→涂片于玻片上→用pH值为6.8的Giemsa染色液染色2~3 h→置于显微镜下镜检,观测单元视野中染色体数目并拍照。

1.3.2 浸渍与套罩处理对刺葡萄种子致死率、芽的成活率及诱变效果统计方法

观测于浸渍播种、套罩刺葡萄芽后,伴随刺葡萄植株的生长与新梢的发生进行。浸渍刺葡萄种子后,种子死亡率统计方法:种子死亡率=播种种子数(100粒)-存活植株数/播种种子数(100粒)×100%。

套罩刺葡萄芽后,萌芽率统计方法:

萌芽率=萌芽数/处理芽数(30个)×100%。各处理诱变率统计方法:

诱变率=产生的变异植株(变异枝蔓)数/镜检植株(镜检枝蔓)数×100%。

1.3.3 叶片形态与含水量观测方法

分别采集已停止生长,具有明显变异特征叶片(2n→4x=76)与对照叶片(2n→2x=38)各50片,用电子数显卡尺测量各处理叶片厚度,求平均值;用有机玻璃直尺测量各处理叶片的长度与宽度,分别求平均值;用电子天平称取各处理叶片鲜重(W鲜);利用烘干法在烘箱里先70℃、后105℃将各处理叶片烘至恒重(W干),利用数学方法计算变异体叶片(4n)与对照叶片(2n)含水量:叶片含水量=(W鲜-W干)/W鲜×100%。

1.3.4 气孔观测方法

晴天上午8∶30~10∶00,分别取已停止生长、具有明显变异特征的叶片(4n)与对照叶片(2n)各10片。用毛笔醮火胶棉溶液于叶背主脉两侧涂一薄层,2~4 min后用镊子揭下溶胶,去掉叶背绒毛。后再于去掉绒毛的叶背主脉两侧涂抹一层,取下凝胶印膜,置于显微镜下观察叶片气孔大小、密度等并拍照。

1.3.5 枝蔓粗度与节间长短观测方法

分别选取已停止生长或进入缓慢生长,具有明显变异特征的枝蔓(4n)与对照枝蔓(2n)各5条,用电子数显卡尺分别测量第3~12节(5×10=50节)节间粗度,求平均值;用有机玻璃直尺分别测量第3~12节(5×10=50节)节间长度,求平均值。

1.3.6 果实内在与外在品质观测方法

2015年9月15日,从具有明显变异特征的刺葡萄枝蔓与对照枝蔓上剪取果穗各15穗,用电子天平分别称取果穗重量,计算4n与2n果穗与果粒平均重量;用便携式手持数显糖度计分别测量处理与对照的可溶性固形物含量,求平均值。

2 结果与分析

2.1 戊炔草胺浸渍与套罩处理后对茎尖与茎段染色体数目的影响

本研究采用去壁低渗法对选取的茎尖与茎段进行镜检的同时,观测了单元视野中染色体数目(见图1~2)。单元视野中观察到对照刺葡萄染色体数目为2n→2x=38,而刺葡萄变异类型的染色体数目大多为2n→4x=76,有少量的染色体数目为2n→2x=38+4、2n→2x=38+6。

2.2 戊炔草胺对刺葡萄种子倍性诱变效应结果分析

图1 刺葡萄二倍体染色体(2n→2x=38) (×5 500)Fig.1 Choro some of diploid on Vitis davidii foex

图2 刺葡萄四倍体染色体(2n→4x=76)(×5500)Fig.2 Choro some of tetraploid on Vitis davidii foex

经过浸渍处理的刺葡萄种子播于“0.618侧腰开孔”“黄金”营养钵中25 d后,对它们形成植株能力强弱等方面进行了观测与统计。从表2可看出,不论是对照还是不同浓度的戊炔草胺处理,随处理时间的延长,形成植株能力呈下降趋势,种子死亡率呈上升趋势。其中,以第12处理即被0.005%戊炔草胺处理36 h的处理,死亡率最高,达92%,这样的统计结果应与戊炔草胺药剂浓度较高、作用时间较长有关。

从图1、图2结合表2看出,不同戊炔草胺浓度和时间浸渍已萌发刺葡萄种子后,除对照以外的各处理均产生了倍性变异植株,且变异植株体内染色体大多由2n=2x=38变成了2n→4x=76。其中,以第8处理即被0.004%戊炔草胺浸渍萌动种子24 h的处理,倍性诱变效果最佳,倍性诱变率达41.7%。

表2 不同浸渍浓度与时间的戊炔草胺对刺葡萄种子倍性诱变效果†Table 2 Different impregnation concentration and time of propyzamide on Vitis dacidii foex seed mutagenic effect

2.3 戊炔草胺对刺葡萄生长芽的倍性诱变效应结果分析

从表3可以看出,用不同浓度的戊炔草胺胶囊套罩相应芽后,芽的萌芽率随戊炔草胺浓度的升高而降低,而变异率在浓度为0.004%~0.006%范围内呈上升趋势,超过0.006%,盲芽率(芽的死亡率)升高,变异率因此受抑制而降低。据此,0.006%浓度的戊炔草胺对处于生长状态的刺葡萄芽套罩6 d有最好的倍性诱变效果,其倍性诱导率达42.8%,且染色体数量大多由(2n=2x=38)变成了(2n→4x=76)(见图1~2)。

表3 不同套罩浓度的戊炔草胺对刺葡萄生长芽倍性诱变效果†Table 3 Different cover concentration of propyzamide onVitis davidii foex growth bud mutation effect

2.4 戊炔草胺对刺葡萄叶片的形态影响

采集具有明显变异特征的刺葡萄叶片(4n)50片、对照(2n) 叶片50片,从形态、大小、叶片厚度等方面进行了观测与分析:从叶片形态方面观察,对照刺葡萄叶片(2n)多为阔卵形,受戊炔草胺影响产生的倍性变异叶片(4n)多为心形;变异体叶片的叶色比对照的更浓绿,变异体叶片叶面较脆且更粗糙;已产生倍性变异的叶片比对照的更厚(见表4);对照叶片虽比已产生倍性变异的叶片长且宽,但从测得的刺葡萄叶片含水量分析,发生倍性变异的刺葡萄叶片含水量为68.3%,对照的为72.1%,由此推断处理叶片比对照叶片的相对含水量低,干物质含量相对较高(见表4)。这些观测结果基本上与石雪晖等[14-15]、邓建平等[7]利用秋水仙素作试剂,诱导刺葡萄倍性变异的研究结果基本一致。

表4 刺葡萄对照(2n)与倍性变异体(4n)叶片形态比较†Table 4 Comparison on Vitis davidii foex leaf morphological between contrast (2n) and times variants (4n)

2.5 戊炔草胺对叶片气孔形态与大小的影响

把从刺葡萄变异体叶的叶背与对照叶的叶背取下的凝胶印膜置于显微镜下进行观测(见图3、4):变异体叶片气孔(4n)的长度和宽度均大于对照(2n),说明变异体叶片的气孔比对照大,变异体叶片的气孔密度比对照的小[7,14-15]。

图3 二倍体刺葡萄气孔(×800)Fig.3 Pores of diploid on Vitis davidii

图4 四倍体刺葡萄气孔(×800)Fig.4 Pores of tetraploid on Vitis davidii

2.6 戊炔草胺对刺葡萄枝蔓粗度与节间长度的影响

从表5可以看出,刺葡萄变异四倍体的节间长度与对照二倍体的相比,节间明显变短,是对照的54.40%;枝蔓节间粗度也明显变细,仅对照的50.10%。这与同源多倍体的生长速率一般低于二倍体有关[13]。这一观测结果与石雪晖等[14-15]的研究趋于一致。

2.7 戊炔草胺对果实外观品质与内在品质的影响

湖南生物机电职业技术学院藤本园中栽植的变异四倍体刺葡萄果实成熟期与对照二倍体的无明显差异,两者都于8月下旬~9月上中旬成熟。成熟后果粒颜色都为蓝黑色,颜色深浅也无显著区别。从表6可以看出,4n果穗与果粒虽比2n稍大,稍重,但都未达到显著水平。变异四倍体的可溶性固形物含量达19.39%,比对照的11.15%明显要高。这一观测结果与石雪晖等[10]的相关研究有相似性。

表5 戊炔草胺对刺葡萄枝蔓粗度与节间长度的影响†Table 5 Effect of Propyzamide on Vitis davidii foex dendrite diameter and internode length

表6 戊炔草胺对果实外形与可溶性固形物的影响†Table 6 Effect of propyzamide on Vitis davidii foex fruit shape and the influence of soluble solids

3 结论与讨论

本试验用浓度为0.004%的戊炔草胺浸渍处于萌动状态的刺葡萄种子24 h,倍性诱变效果最佳,倍性诱变率达41.7%;用0.006%浓度的戊炔草胺套罩处于生长状态的刺葡萄芽6 d,倍性诱变效果最好,倍性诱变率达42.8%;在适宜时间段内、用适宜浓度的戊炔草胺分别处理刺葡萄的种子与芽后,诱使刺葡萄发生了倍性诱变,成功使刺葡萄体内的染色体数量大多由2n=2x=38变成了2n→ 4x=76。

对已发生倍性诱变的刺葡萄叶、叶片气孔、枝蔓粗度与节间长度、果实外观与内在品质进行观测后,发现:第一,发生倍性变异的刺葡萄叶片表面更粗糙、叶片更厚、叶片内干物质的相对含量更高,这与杨小胡等[17]、研究结果大致相同。第二,刺葡萄变异体叶片气孔(4n)的长度和宽度均大于对照(2n),说明变异体叶片的气孔比对照大,气孔密度比对照的小[7,17-18]。第三,刺葡萄变异四倍体的节间长度比对照二倍体的明显变短,是对照的54.40%;枝蔓节间粗度也明显变细,仅对照的50.10%。这与同源多倍体的生长速率一般低于二倍体有关[13,19]。第四,4n刺葡萄果穗与果粒虽比2n的稍大,稍重,但都未达到显著水平[10,17,19]。变异四倍体的可溶性固形物含量达19.39%,比对照的 11.15% 明显要高[10,17,19]。

以往在诱导植物的倍性诱变方面使用的药剂大多是秋水仙素,但秋水仙素是一剧毒植物碱,且成本较高。戊炔草胺(propyzamide)于当前生产上虽是除草剂的一种,但它和秋水仙素一样,是一种抗微管物质,能诱使植物细胞核内染色体成功加倍[8-16]。本试验结果证实,低浓度、低剂量的戊炔草胺确能使刺葡萄发生倍性诱变,且倍性诱变效果比秋水仙素好。所以,戊炔草胺与秋水仙素相比,它确有低毒性、低浓度、低剂量、低成本、高诱导率等优势,所以,在今后的植物倍性诱导与新品种选育过程中,戊炔草胺完全可作为一种新型诱变试剂取代秋水仙素[4,6-12]。

作用于刺葡萄芽的最适戊炔草胺浓度为0.006%,比作用于刺葡萄种子的最适浓度0.004%高出0.002%,且作用于芽的时间比作用于种子的长120 h。试验中表现出的这种最适浓度差异与时间差异,可从环境因子特别是温度因子的角度作出合理解释:戊炔草胺作诱导试剂的刺葡萄种子浸渍试验是在25 ℃左右这一最适大多数植物种子与植物生长发育的温度下进行的,而刺葡萄芽的套罩试验是在3月下旬的室外进行的。据从中国科学气象数据共享服务网查找的数据,2014年3月,湖南长沙地区平均气温13.5 ℃,气温变化范围6.1~23.5 ℃,很显然,这并不是植物生长发育的最适温度条件。由此说明,诱导试验中使用的戊炔草胺浓度高低、作用时间长短与诱导效果好坏,与被作用器官的生长状态有关,更与当时的温度因子有很大相关性:温度高,诱导变异的最适浓度须降低、作用时间短,反之浓度则高、作用时间需长。

石雪晖等[6]在2007年3月初利用秋水仙素浸渍刺葡萄种子的对照试验中,清水浸渍24 h的种子死亡率为17%,浸渍36 h的死亡率为21%。在本次2014年3月初利用戊炔草胺浸渍刺葡萄种子的对照试验中,清水浸渍种子24 h的死亡率仅为1%,浸渍36 h时仅为4%。两对照试验中种子死亡率差异显著。造成此显著差异的原因在避开试剂浓度高低、浸渍时间长短等因素外,主要应与浸渍液中含氧量的高低有很大关系。在摇床的作用下,可使浸渍液中富含充足的氧,因而种子的死亡率显著降低。当然,本浸渍试验中种子成活率与植株成活率的高低可能还与利用了“0.618侧腰开孔”“黄金”营养钵有关,因“黄金杯”能确保播种其中的种子与生长其中的植株对氧与水分的需求,因而植株成活率高。

戊炔草胺不能直接溶于水。试验与生产中,一般先将戊炔草胺的晶状体充分溶解于二甲基亚砜(DMSO),后用蒸馏水定容至刻度。二甲基亚砜可增强戊炔草胺对植物组织的穿透能力,同样对皮肤组织也有较强穿透性,因此,操作者在配制二甲基亚砜与戊炔草胺溶液时,须带手套操作。

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Studies of propyzamide on polyploidy mutation ofVitis davidii

CAI Dong-yuan, LIN Ji-hua, DENG Jian-ping
(Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic College, Changsha 410127, Hunan, China)

Processing and control stem section, stem tip under a microscope, the observed controlVitis davidiifoex chromosome number is 2n=2x=38[1-7], most variation types of chromosome number is 2n→4x=76, a small amount of chromosome number is 2n→2x=38+4, 2n→2x=38+6; 0.004% propyzamide spirit treatment on the germination ofVitis davidiifoex seed soaking for 24h has the best effect of ploidy mutagenesis, mutation rate was 41.7%; 0.006% propyzamide spirit processing set cover was under a state of growth of buds, ploidy mutagenic effect best, mutation rate was 42.8%.Different concentration of propyzamide respectively applied toVitis davidiifoex have germination of seeds and of bud, there were good times sex mutagenic effects.Vitis davidiifoex has the characteristics of small particles, more seeds, etc.This study used different concentrations of propyzamide for ploidy mutagenesis reagent, respectively applied toVitis davidiifoex has seed germination and growth status of bud, inducesVitis davidiifoex chromosome ploidy variation, for breeding seedless or less, big grain, high quality ofVitis davidiifoex new types and new ploidy breeding materials with more abundant resources.

propyzamide; colchicine;Vitis davidii; polyploidy; mutation

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.07.018

http: //qks.csuft.edu.cn

S722.3

A

1673-923X(2016)07-0103-06

2015-06-03

湖南省科技计划重点项目(2012FJ4565);湖南省农业厅项目(2014NY03)

蔡冬元,副教授

邓建平,教授;E-mail:caidongyuan911@126.com

蔡冬元,林继华,邓建平.戊炔草胺(propyzamide)作用于刺葡萄的倍性诱变研究[J].中南林业科技大学学报,2016,36(7): 103-108.

[本文编校:吴 毅]

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