珍龙醒脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

项颖卿 涂长春 章国良

(江西科技学院护理学院，江西 南昌 330098)



珍龙醒脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

项颖卿 涂长春1章国良2

(江西科技学院护理学院，江西 南昌 330098)

目的 探讨珍龙醒脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤细胞凋亡及Bcl-2、Caspase-3表达的影响。方法 健康SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注损伤模型组、珍龙醒脑低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高剂量组(200 mg·kg-1·d-1)。每组6只。术前实验性灌胃给药，珍龙醒脑组分别灌注不同剂量药液，假手术组和模型组灌注等量生理盐水。连续给药7 d后采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。假手术组和模型组给予生理盐水。术后6、12、24、48、72 h断头取脑。用TUNEL法检测大鼠皮质和海马神经细胞凋亡率，免疫组化法观察Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。结果 与模型组比较，珍龙醒脑组神经细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表达上调、Caspase-3 蛋白表达下调(P均<0.01)，珍龙醒脑中、高剂量组与低剂量组比较，神经细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白表达上调、Caspase-3 蛋白表达下调(P均<0.01)。结论 珍龙醒脑可抑制大鼠神经细胞凋亡，促进缺血脑组织Bcl-2表达、抑制Caspase-3表达，以珍龙醒脑中、高剂量效果明显。

珍龙醒脑；脑缺血再灌注损伤；细胞凋亡

研究发现〔1〕，珍龙醒脑胶囊可以溶解血栓、消除动脉粥样硬化斑块、解除血管平滑肌痉挛、扩张血管、改善微循环、增加血流速度、降低血液黏度、扩张微小动静脉、降低脑血管通透性，减少自由基损伤、改善脑梗死的预后，尤其在减少脑梗死后遗症、促进语言肢体机能恢复等方面疗效显著。动物实验证明珍龙醒脑胶囊通过降低丙二醛(MDA)含量，升高超氧化物歧化酶(SOD)、Na+-K+-ATP酶活力，有效降低脑含水量，对小鼠脑缺氧及缺血再灌注损伤具有保护作用，其抗脑缺血再灌注损伤作用与保护脑组织ATP酶活性、抑制脂质过氧化反应和减轻自由基损伤有关〔2〕。有关珍龙醒脑胶囊对神经细胞凋亡影响的报道很少。本实验观察珍龙醒脑胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，雌雄各半，体重220～300 g,由江西中医药大学动物科学部提供。合格证号：JZDW No2013-0024。

1.2 药物与试剂 珍龙醒脑胶囊，青海金诃藏药药业股份有限公司生产，批号：国药准字Z20026000；TUNEL试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供，Bcl-2、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体，SP 法免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，均由北京博奥森生物技术有限公司生产。

1.3 分组与给药 健康SD大鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、珍龙醒脑低(50 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和高剂量组(200 mg·kg-1·d-1)。每组6只。术前实验性灌胃给药，珍龙醒脑组组分别灌注不同剂量药液，假手术组和模型组灌注等量生理盐水。连续给药7 d。采用线栓法制作大鼠脑缺血再灌注损伤模型。假手术组和模型组给予生理盐水。

1.4 造模及取材 采用改良Longa等〔3〕线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型。假手术组除不插线外，其余步骤相同。 模型制作成功后，在各时间点取材，水合氯醛过量麻醉，迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后灌注生理盐水250 ml剪开右耳，快速冲洗，再用4%多聚甲醛250 ml灌注，直到头部变硬，断头取脑，去除嗅球、小脑和脑干。冰盘上迅速分离大脑半球，弃去健侧，取视交叉前后约20～30 mm范围的冠状切片，放入10%福尔马林中固定，24 h之内石蜡包埋。

1.5 TUNEL神经细胞凋亡检测 脑组织按常规石蜡包埋，TUNEL法标记凋亡细胞，苏木素复染。在光镜下，正常细胞的细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核则呈深浅不一的棕褐色。每张切片随机选取5个不重叠的视野，输入计算机进行图像分析，计算每个视野的凋亡细胞个数和正常细胞数，计算细胞凋亡指数，取平均值。

1.6 Bcl-2、Caspase-3免疫组化检测 取石蜡切片，脱蜡至水。采用SP免疫组化法观察Bcl-2、Caspase-3蛋白表达。阴性对照组以0.01 mol/L PBS代替一抗，其余步骤不变。镜下观察胞质呈棕褐色的细胞为阳性细胞。数码相机进行显微摄影。每张切片随机选取5个不重叠的视野，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件系统进行图像采集(显微镜20×10倍)，测定阳性表达的面积密度和平均光密度，计算整合光密度(IOD)。IOD=面积密度×平均光密度。

1.7 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1 神经细胞凋亡情况 假手术组未见或仅见少量凋亡细胞。模型组可见缺血半暗带区内有大量凋亡细胞存在。光镜下凋亡细胞表现为胞核被染成淡棕色。脑缺血再灌注6 h后，神经细胞已经出现凋亡，此后神经细胞凋亡率逐渐升高，脑缺血后24～48 h达到高峰，72 h后呈现下降趋势。模型组各时间段神经细胞凋亡率明显高于假手术组(P<0.01)。珍龙醒脑组各时间段神经细胞凋亡率与模型组比较明显减少(P均<0.01)；珍龙醒脑中、高剂量组与低剂量组比较，神经细胞凋亡率明显减少(P均<0.01)。见表1。

2.2 大脑皮层及海马区Bcl-2蛋白表达情况 Bcl-2阳性细胞主要位于海马及皮层缺血梗死灶边缘缺血半暗带区，梗死灶中心区少见阳性细胞，阳性细胞主要是神经元细胞和小胶质细胞，胞质呈棕黄色，染色均匀。结果显示，模型组和珍龙醒脑组脑缺血再灌注6 h后Bcl-2表达增加，12～24 h达高峰，48 h后呈现下降趋势，与假手术组比较差异显著(P均<0.01)。珍龙醒脑组与模型组比较，大鼠缺血区皮质和海马Bcl-2阳性表达均明显增加(P均<0.01)，珍龙醒脑中、高剂量组与低剂量组比较，Bcl-2表达明显增加(P均<0.01)。见表2。

2.3 大脑皮层及海马区Caspase-3蛋白表达情况 假手术组Caspase-3表达极少，模型组缺血6 h后Caspase-3表达增加，12～24 h达高峰，48 h后呈现下降趋势。珍龙醒脑组与模型组比较，大鼠缺血区皮质和海马Caspase-3阳性表达均明显减少(P均<0.01)，珍龙醒脑中、高剂量组与低剂量组比较，Caspase-3表达明显减少(P均<0.01)。见表3。

表1 珍龙醒脑对大鼠不同时间段脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡率的影响(n=6,)

组别6h12h24h48h72h假手术组模型组珍龙醒脑低剂量组珍龙醒脑中剂量组珍龙醒脑高剂量组0.96±0.2838.03±3.121)26.45±1.232)14.25±1.042)3)13.24±1.722)3)1.04±0.1355.67±2.741)26.34±3.192)17.15±2.732)3)16.53±1.652)3)0.90±0.0868.72±2.951)45.37±3.082)22.18±2.772)3)20.72±3.132)3)1.03±0.1874.23±3.541)50.33±3.072)18.65±2.112)3)18.74±1.792)3)0.99±0.1056.64±2.741)40.30±1.192)13.05±1.032)3)12.78±1.172)3)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01；与低剂量组比较：3)P<0.01，下表同

表2 珍龙醒脑对大鼠不同时间段脑缺血再灌注损伤Bcl-2表达影响(n=6,)

组别6h12h24h48h72h假手术组模型组珍龙醒脑低剂量组珍龙醒脑中剂量组珍龙醒脑高剂量组6.38±0.0428.03±3.121)56.64±0.972)54.28±1.852)3)58.55±2.42)3)5.27±0.5465.67±3.141)86.86±3.092)117.15±2.732)3)126.53±1.652)3)4.26±0.7898.72±2.951)163.31±4.082)202.56±3.162)3)217.35±5.362)3)6.03±0.1484.23±3.541)150.63±5.242)158.65±2.112)3)178.74±1.792)3)5.99±0.1166.64±2.741)98.30±4.192)103.05±1.032)3)112.78±1.172)3)

表3 珍龙醒脑对大鼠不同时间段脑缺血再灌注损伤Caspase-3表达影响(n=6,)

组别6h12h24h48h72h假手术组模型组珍龙醒脑低剂量组珍龙醒脑中剂量组珍龙醒脑高剂量组4.16±0.3735.03±4.091)26.64±1.262)26.28±1.362)3)28.55±1.522)3)6.04±0.3975.67±3.341)60.86±3.142)57.15±2.602)3)54.70±1.872)3)5.37±0.16148.62±3.971)87.42±3.682)68.46±3.262)3)65.47±3.052)3)4.93±034112.23±4.671)74.53±3.972)58.35±2.452)3)60.74±2.412)3)5.34±0.1689.64±5.301)60.30±2.542)45.05±1362)3)42.33±1.372)3)

3 讨 论

局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元的死亡包括坏死和凋亡两种方式，在缺血严重的梗死中心区神经元的死亡以坏死为主，而在缺血半暗带区，存在大量的凋亡细胞。Caspase-3是Caspase 级联“瀑布下游”最关键的凋亡执行蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后枢纽作用〔4〕。 Bcl-2是目前首个被确认有抑制细胞凋亡作用的因子，可通过多种途径抑制细胞凋亡的发生〔5〕。Caspase-3 作为Bcl-2 的生理性半胱氨酸蛋白酶，对Bcl-2蛋白具有重要的酶解修饰作用，在细胞发生凋亡时，通过酶切Bcl-2 蛋白来抑制Bcl-2的抗凋亡作用；另一方面，Bcl-2 作为Caspase-3 的上游调控因子，其过度表达可以有效抑制各种因素诱导的Caspase-3 激活和由此产生的细胞凋亡〔6〕。本实验发现，假手术组大鼠脑皮质和海马区均可以见到少量的凋亡细胞，这说明神经细胞凋亡在生理情况下也存在。它是维持机体内环境稳定的机制之一。珍龙醒脑能使神经细胞凋亡指数下降，证实了珍龙醒脑对脑缺血损伤的保护作用。脑缺血再灌注损伤可以激活抗凋亡基因Bcl-2的转录，增强机体的内源性保护作用。珍龙醒脑胶囊具有上调Bcl-2表达、减少脑缺血病灶周围Caspase-3阳性细胞表达的能力，提示珍龙醒脑能抑制皮质和海马神经元凋亡，对脑神经细胞具有保护作用。

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2 高 伟，张会鲜，孙建云，等.珍龙醒脑胶囊对小鼠脑缺氧及脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(11)：4958-60.

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5 林海平，王 永，沈 燕，等.大鼠脑缺血再灌注损伤中细胞凋亡相关调控因子的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2014;9(34)：2589-91.

6 Cooke DT,Hoyt EG,Robbins RC,etal.Over expression of human Bcl-2 in syngeneic rat donor lungs preserves post-transplant function and reduces intragraft caspase activity and interleukin-1 beta production〔J〕.Transplantation,2005；79(7):762-7.

〔2015-06-08修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

江西科技学院校级自然科学基金(ZR13YB07)

1 南昌大学药学院 2 南昌市第二医院检验科

项颖卿(1976-)，女，硕士，讲师，主要从事心脑血管药理、老年护理研究。

R4

A

1005-9202(2016)23-5835-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.027