取向TSF/p LLA静电纺纳米纤维毡的制备及其生物相容性

邵伟力，高艳菲，何建新，王 倩，陈 利，崔世忠

（1.天津工业大学纺织学院，天津 300387；2.中原工学院纺织学院，河南郑州 450007；3.纺织服装产业河南省协同创新中心，河南郑州 450000）

取向TSF/p LLA静电纺纳米纤维毡的制备及其生物相容性

邵伟力1，2，3，高艳菲1，2，3，何建新2，3，王 倩2，3，陈 利1，崔世忠1，2，3

（1.天津工业大学纺织学院，天津 300387；2.中原工学院纺织学院，河南郑州 450007；3.纺织服装产业河南省协同创新中心，河南郑州 450000）

利用静电纺丝技术制备了取向的柞蚕丝素/左旋聚乳酸（TSF/PLLA）纳米纤维毡。通过扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射分析（XRD）和拉伸测试分别对TSF/PLLA纳米纤维的形貌、结晶结构及力学性能进行了研究。将人成骨肉瘤细胞（MG-63）种植在TSF/PLLA纳米纤维上，通过荧光显微镜分析和MTT（四甲基偶氮噻唑蓝比色法），观察细胞在材料表面的生长情况，评价纳米纤维的生物学性能。结果表明，TSF含量为10％时，纤维直径分布均匀，结晶度高。但是，TSF含量超过10％后，纤维直径粗细不匀明显，纤维的力学性能下降。与无规纤维毡相比，取向的纳米纤维毡力学性能优异，初始模量高，更能够促进细胞增殖，对细胞的生长行为影响大。

柞蚕丝素;聚左旋乳酸;取向纳米纤维;生物学性能

1 引 言

支架材料的制备是组织工程研究的核心技术之一。由于单一材料很难满足组织工程的支架材料的要求，由单一材料发展为复合材料已是大势所趋，尤其是人工合成材料与天然材料之间的复合、改性是组织工程的支架材料的研究热点［1-3］。

丝素蛋白是天然高分子纤维蛋白，可以用不同的溶剂或与其它的高聚物混合制备静电纺丝用于制作工程支架［4-5］，然而目前的研究都是基于桑蚕丝素，而对柞蚕丝素的研究却很少，王晓磊等使用水作为溶剂，通过静电纺丝技术制备了形貌较好的柞蚕丝素纳米纤维［6］。柞蚕丝素因为含有Arg-Gly-Asp三肽序列而被认为是很有潜力的生物支架材料。聚左旋乳酸（Poly l-lactic，PLLA）是一种无毒、无刺激性生物高分子材料，具有良好的生物降解性，但也存在一定的缺陷，例如力学强度不高、高疏水性等导致细胞亲和性差，使其应用受到限制［7］。本文将TSF和PLLA进行复合，实现材料的优化设计，以制备生物相容性好的支架材料。

由于静电纺纳米纤维在结构和尺寸上与天然细胞外基质相似，因此可作为支架材料促进细胞的黏附、生长、分化［8］，而且有研究表明纳米纤维的取向对细胞的生长有很大的影响［9］，但是目前用于支架材料的纳米纤维都是无规取向的纤维毡，导致其力学性能和二次成型性都受到了限制。本文通过静电纺丝技术制备了取向的TSF/PLLA纳米纤维毡，并在体外与人成骨肉瘤细胞（MG-63）复合培养，观察其生物学性能以期能够用于组织工程的支架材料。

2 实验材料与方法

2.1 原材料

柞蚕茧（购自中国河南南阳）、聚左旋乳酸（PLLA，重均分子量为10万，国药集团），MG-63细胞株（购自国家实验细胞资源共享平台）、MEM-EBSS培养基（购自美国Hyclone公司）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，购自美国Hyclone公司）、NEAA（非必需氨基酸，购自美国Hyclone公司）、PBS液（购自美国Hyclone公司）、若丹明-毒伞素（Sigma），所有试剂均为分析纯。

2.2 TSF/p LLA纺丝液的制备

按照1：30的浴比将柞蚕蚕茧放入0.5％的碳酸钠溶液中，煮沸脱胶三次，用去离子水冲洗，然后在室温下干燥。将脱胶后的柞蚕丝置于9mol/L硫氰酸锂溶液中50℃搅拌溶解2h，然后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析3d。将透析后的溶液鼓风浓缩，然后冷冻干燥制得纯柞蚕丝素膜。将TSF和PLLA按照不同的质量比混合后置于六氟异丙醇中，在25℃磁力搅拌器搅拌一周制得质量分数为8％的纺丝溶液。

2.3 纺丝液导电率测试

在室温条件下用DDS-11A数显导电率仪测试纺丝液的导电率，所用电极为DJS-1型铂黑电极，实际电导率常数J=0.996。

2.4 TSF/p LLA纳米纤维毡的制备

图1为TSF/PLLA纳米纤维毡纺丝装置示意图，纺丝电压20k V，纺丝距离18cm，纺丝流量0.3m L/h，无规的纳米纤维毡采用铝箔收，取向的纳米纤维毡利用旋转滚筒装置接收，转速为1000r/min。

图1 TSF/PLLA纳米纤维毡静电纺丝装置示意图Fig.1 Schematic of TSF/PLLA nanofibers electrospinning device

2.5 扫描电镜分析

采用JSM-6360型扫描电子显微镜观察纳米纤维表面形貌。测试条件：恒温20℃，相对湿度65％，加速电压15k V，测试前样品进行镀金处理。

2.6 X射线衍射分析

纤维样品的X射线衍射分析在D/max-2550PC 18k W转靶X射线衍射仪上测定。样品安放在玻璃的样品架上，在稳定条件下分析。测试条件：Ni滤波，Cu靶Kα射线，管压40k V，管流40m A，扫描速度2°/min，从5°到50°。

2.7 力学性能测试

用美国Instron3365电子强力仪进行拉伸力学性能测试。用于测试的纤维毡样品长、宽分别30mm、10mm，厚度约为0.15mm～0.30mm。试样夹持长度10mm，拉伸速度10mm/min，初始张力为0.2c N。每试样测定10次，最后取平均值。

2.8 细胞培养

在37℃，5％CO2，95％湿度条件下无菌培养MG-63成骨细胞。在倒置显微镜下观察，当MG-63细胞形成单层，铺满培养瓶底80％以上时，进行传代。用PBS液清洗培养瓶三次，加入胰酶-EDTA消化3分钟，1000r/min离心5min，弃上清夜加入含10％胎牛血清的MEM培养基，吹打成均匀细胞悬液，调整细胞密度为1×l04/m1于培养瓶中继续培养，隔天换液。

2.9 细胞与材料的复合

先将灭菌后的材料放于24孔板中，浸泡于含10％胎牛血清的MEM培养基24小时，再接种MG-63细胞于孔板中。然后根据分组需要调整细胞密度，将密度为5×104个/细胞悬液加入到相应的24孔板，每孔加入1ml，进行细胞的形态学观察及MTT（四甲基偶氮噻唑蓝比色）测定。

2.10 荧光显微镜测试

对培养7d的细胞支架材料进行荧光染色分析，用4％的多聚甲醛室温固定30min后PBS缓冲液稀3次，每次10min。在0.2％Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）溶液处理细胞以获得通透性细胞，然后用若丹明-毒伞素和DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）分别对细胞肌动蛋白和细胞核进行染色，最后在荧光显微镜（尼康E200）下观察。

2.11 MTT法测定细胞在材料上的增殖情况

首先将各组材料放入24孔培养板中，用含10％胎牛血清的MEM培养基浸泡24h，然后调整MG-63细胞密度为1×105个/ml，接种于放有不同材料的培养板内，每孔加入培养液lml，然后分别于第1、4、7d各取三组材料加入MTT溶液，继续培养4h，终止培养后，弃上清液，每孔加入420μL（DMSO（二甲基亚砜）），振荡10分钟。吸取每孔液体100μL到96孔平底板内，选择492nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录并分析结果。

2.12 统计分析

有关数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，实验数据用±s表示，组内数据资料采用重复测量方差分析，两组间结果分析采用t检验，P＜0.05被认为有统计学意义。

图2 TSF/PLLA纳米纤维毡的扫描电镜图片（a）PLLA+10％TSF无规;（b）pure PLLA;（c）PLLA+10％TSF;（d）PLLA+15％TSF;（e）PLLA+20％TSFFig.2 SEM of TSF/PLLA nanofibers （a）PLLA+10％TSF random;（b）pure PLLA;（c）PLLA+10％TSF;（d）PLLA+15％TSF;（e）PLLA+20％TSF

3 结果分析与讨论

3.1 TSF/p LLA纳米纤维毡的形貌分析

图2显示了不同TSF含量的静电纺TSF/PLLA纳米纤维的SEM照片。图3为TSF/PLLA纳米纤维直径分布与导电率曲线图。添加10％TSF的PLLA纺丝液显示了良好的静电纺的可纺性，无规和取向的纳米纤维均呈现稍扁的形貌，而且具有均匀的直径分布，图2b、c、d、e均显示纳米纤维具有较好的取向，添加少量的TSF（不超过10％）后，纳米纤维的直径变化明显，从899nm直接减小到593nm，其原因是TSF大分子链中含有较多的极性侧基，添加后纺丝溶液的导电率得到提高，在静电纺丝过程中纳米纤维得到了充分拉伸，纤维直径变得更细。但TSF的添加量超过10％时，纳米纤维出现了明显的粗细节，直径分布不匀显著增加，这是因为随着TSF含量的不断提高，TSF与PLLA相容性逐渐变差（见之后结果分析），而且TSF大分子之间容易团聚，这些因素会导致在静电纺丝时泰勒锥非常不稳定，纤维直径不匀性变大。

图3 TSF/PLLA纳米纤维毡直径分布与导电率曲线图Fig.3 Diameter distribution and Conductivity curve of TSF/PLLA nanofibers

3.2 X-射线衍射分析

图4所示为不同丝素含量静电纺TSF/PLLA纳米纤维毡的X衍射分析结果。从图可以看出纯的PLLA纳米纤维毡和含有10％TSF的TSF/PLLA纳米纤维毡的峰形均较尖锐，且强度较高，结晶度较大，这是因为PLLA和TSF分子之间形成了氢键结合，提高了分子间的规整性。两者峰形一致说明纺丝过程对晶型及结晶度均没有影响，但是当TSF的含量达到15％时，在2θ=10.64°附近出现了较弱的归属于丝素I的特征衍射峰，说明在TSF浓度较高（超过10％达到15％）时，纺丝液中TSF和PLLA的相容性较差。

图4 TSF/PLLA纳米纤维毡的衍射图谱Fig.4 X-ray diffraction patterns of TSF/PLLA nanofibers

3.3 力学性能

TSF/PLLA纳米纤维毡应力-应变曲线如图5所示，取向的纳米纤维毡均展现出较高的初始模量，纯PLLA取向纳米纤维毡断裂伸长最大，达到100％左右。添加少量的TSF后，TSF/PLLA纳米纤维毡的强度得到了较大改善，这是因为少量的TSF大分子与PLLA充分混合后，TSF主链上的活泼氢原子与PLA主链上氧原子的孤对电子形成了氢键。TSF含量为10％时，取向的TSF/PLLA纳米纤维毡力学性能较好，初始模量变大，断裂强度达到1.96MPa，断裂伸长率为79.8％;但是当TSF含量超过10％后，取向TSF/PLLA纳米纤维毡的力学性能明显下降，特别是当添加20％的TSF时，取向纳米纤维毡的断裂强度和断裂伸长率分别只有1.06MPa、19.3％左右。

图5 TSF/PLLA纳米纤维毡的应力-应变曲线Fig.5 Stress-stain curve of TSF/PLLA nanofibers

3.4 生物学表征

图6为MG-63细胞在纯PLLA纳米纤维毡和TSF/PLLA纳米纤维毡上培养7 d后的荧光显微镜照片。照片中细胞肌动蛋白显示为红色，细胞核显示为蓝色，可以看出添加TSF后细胞的数量明显增多，说明添加TSF使得纳米纤维材料的生物相容性得到改善，诱导细胞的分裂增殖能力提高，这是因为TSF中富含R-G-D三肽序列，这种序列可用作生物识别，更有利于细胞的粘附和增殖［10］。取向的纳米纤维毡表面不仅细胞的数量增多，细胞分布较均匀，而且细胞生长排列得很规整，和纤维取向是一致的，说明所制备的纳米纤维毡的取向性对细胞的生长行为有很大影响，这也提示材料的表面结构对细胞生长有一定影响。

图7为不同时间点细胞在材料上的增殖曲线，MTT检测是一种检测细胞存活和生长的方法，OD值的大小代表细胞的增殖能力和细胞活性。从图中可以看出，随着时间的延长，各组的OD值整体趋势增大，说明细胞数目在不断增加，不同的时间点细胞增殖均具有统计学差异（p＜0.05），添加少量TSF后发现OD值明显升高，说明MG-63细胞在含有TSF的纳米纤维毡上的生长和增殖比在纯的PLLA纳米纤维毡上要好，通过加入TSF改善了PLLA的细胞相容性。但是TSF的添加量过多（超过10％）时TSF/PLLA纳米纤维毡细胞相容性有所下降，这可能归因于TSF浓度较高时所形成的纳米纤维毡直径分布不均匀所致，有研究［11］表明纳米纤维的结构、孔隙率对于细胞的粘附、增殖和分化影响很大。此外，还发现取向的TSF/ PLLA纳米纤维毡较无规的纤维毡能够更好地促进细胞的黏附和增殖。

图6 细胞在TSF/PLLA纤维毡表面生长的荧光显微镜照片（a）Pure PLLA;（b）PLLA+10％TSF（无规）;（c）PLLA+10％TSF（取向）Fig.6 Fluorescent microscope picture of cells on TSF/PLLA nanofibers

图7 不同时间点细胞在材料上的增殖曲线Fig.7 Growth curve of cells on the material at different time points

4 结 论

1.本研究成功制备了取向的TSF/PLLA纳米纤维毡，添加10％TSF后，纳米纤维直径变小，分布均匀，结晶度高。取向的TSF/PLLA纳米纤维毡断裂强度达到1.96MPa，断裂伸长率为79.8％。当添加的TSF含量超过10％后，纤维直径不匀性增加，力学性能下降。

2.与无规的纳米纤维毡相比，取向的纳米纤维毡具有更优异的力学性能，初始模量高，生物相容性好，更能促进细胞的增殖，而且细胞在材料表面的生长排列方向和纳米纤维的取向是一致的，这对以后我们研究设计组织工程支架材料具有很积极的参考价值。

［1］Hutmacher DW.Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage［J］.Bio materials，2000，21（24）：2529～2543.

［2］Wang M，Bonfield W.Chemically coupled hydroxyapatite polyethylene composites：structure and properties［J］. Biomateria1s，2001，22：1311～1320.

［3］Yasuhiko I.Reduction of surface induced in ammatory reaction on PLGA/MPC polymer blend［J］.Biomateria1s，2002，23：3897～3903.

［4］Ohgo K，Zhao C，Kobayashi M，et al.Preparation of nonwoven nanofibers of Bombyx mori silk，Samia Cynthia ricini silk and recombinant hybrid silk with electrospinning method［J］. Polymer，2003，44：841～846.

［5］CHEN C，CAO C B，MA X L，et al.Preparation of non-woven mats from all-aqueous silk fibroin solution with electrospinning method［J］.Polymer，2006，47（18）：6322～6327.

［6］王晓磊，戴卫国，何建新，等.柞蚕丝素水溶液静电纺纳米纤维的制备［J］.材料科学与工程学报，2012，30（2）：287～290.

［7］马永富，刘阳，梁朝阳，等.PLLA/HA复合材料电纺丝覆膜气管支架的制作及力学性能的基础研究［J］.中国医药导报，2013，10（3）：154～157.

［8］肖红伟，张红萍，应黎君，等.核/壳结构复合纳米纤维的制备［J］.丝绸，2010，8（08）：19～23.

［9］Ashleigh Cooper，Narayan Bhattarai，Miqin Zhang.Fabrication and cellular compatibility of aligned chitosan-PCL fibers for nerve Tissue［J］.Regeneration Carbohydrate Polymers，2011，3（85）：149～156.

［10］G.H.Altman，F.Diaz，C.Jakuba，et al.Silk-based biomaterials［J］.Biomaterials，2003，24（3）：401～416.

［11］Vargas EA，Baracho NC，Brito J.Hyperbrancbed polyglycerol electrospun nanofibers for wound dressing applications［J］.Acta Biomaterialia，2010，6（3）：1069～1078.

preparation and Biological properties of Aligned TSF/p LLA Electrospun Nanofibers

SHAO Wei-li1，2，3，GAO Yan-fei1，2，3，HE Jian-xin2，3，WANG Qian2，3，CHEN Li1，CUI Shi-zhong1，2，3
（1.School of Textiles，Tianjin polytechnic University，Tianjin 300387，China; 2.School of Textiles，Zhongyuan University of Technology，Zhengzhou 450007，China; 3.Collaborative Innovation Center of Textile and Garment Industry，Henan province，Zhengzhou 450007，China）

Aligned TSF（tussah silk fibroin）/Poly l-lactic（PLLA）electrospun nanofibers were successfully fabricated by electrospinning technique.The morphology，secondary structure and mechanical property of the TSF/PLLA nanofibers were characterized by scanning electronic microscope，X-ray diffraction（XRD）and tensile test.Human osteosarcoma cells（MG-63）was cultured in vitro to study the biological properties of TSF/PLLA nanofibers，which was characterized by fluorescence microscope test and four methyl azo thiazole blue colorimetric（MTT）.The results indicated that TSF/PLLA nanofibers had the uniform diameter distribution and high crystallinity when TSF content was 10％.However，the diameters of the fibers were less even and the mechanical properties decreased when the content of TSF was over 10％.Compared with random fiber mat，aligned TSF/PLLA nanofibers showed high mechanical performance and high initial modulus，and we found that aligned TSF/PLLA nanofibers could enhance cell proliferation and had a great effect on cell growth behavior.

tussah silk fibroin（TSF）;poly l-lactic（PLLA）;aligned nanofibers;biological properties

TS102.1

A

10.14136/j.cnki.issn 1673-2812.2016.03.010

1673-2812（2016）03-0384-06

2014-10-20;

2015-02-03

国家自然科学基金资助项目（51203196，U1204510）;NSFC-河南人才培养联合基金资助项目（U1204510）;河南省教育厅科学技术研究重点资助项目（14A540003，14A540006）;郑州市普通科技攻关资助项目（141PPTGG400）

邵伟力（1987-），男，博士研究生，研究方向为纺织复合材料。E-mail：weilishao@163.com。

何建新，男，教授，主要从事静电纺纳米复合材料研究。E-mail：hejianxin 771117@163.com。