基于焦磷酸测序的花生过敏原基因Ara h6检测技术研究

房保海 贾俊涛 赵丽青 庞国兴 门爱军 岳志芹 梁成珠 徐 彪

(山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心1，青岛 266002)(青岛出入境检验检疫局2，青岛 266000)(山东出入境检验检疫局3，青岛 266000)

基于焦磷酸测序的花生过敏原基因Ara h6检测技术研究

房保海1贾俊涛1赵丽青1庞国兴2门爱军3岳志芹1梁成珠1徐 彪1

(山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心1，青岛 266002)(青岛出入境检验检疫局2，青岛 266000)(山东出入境检验检疫局3，青岛 266000)

应用焦磷酸测序技术建立了检测食品中花生过敏原基因Ara h6的快速检测方法，该检测方法对花生过敏原成分具有很好的特异性和重现性，测序结果在GenBank中进行同源性比对分析，表明目标序列能够作为鉴定花生过敏原成分很好的特征序列，为食品中的花生过敏原成分快速检测提供良好的技术支撑，保证了食品进出口和食用安全。

焦磷酸测序 花生 过敏原 Ara h6

过敏性疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一，是当前世界性的重大卫生学问题，世界各国过敏反应性疾病的总发病率高达10%～30%，此类型疾病包括食物过敏、过敏性哮喘和过敏性鼻炎等，是临床上的常见病、多发病[1-2]。世界粮农组织1995年报告，90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起[3]。

食物中能使机体产生过敏反应抗原分子称为食物过敏原，它们大多为蛋白质[4-5]。据报道，花生过敏占食物过敏的10%～47%[6]，是重要的食物过敏原，可引起过敏性肠炎、过敏性皮炎等过敏性疾病，严重的甚至会发生过敏休克和过敏性死亡。国内外对食用花生所引起的过敏性死亡案例均有报道[7]。鉴于目前尚无根治这类疾病的方法，美国及欧盟等国家要求在食品标签上加注花生等主要过敏原成分标签以防止过敏患者误食[8-9]。同时，美国及欧盟等国家开始对部分进口食品进行花生过敏原抽检，而我国食品出口企业常因食品过敏原标注不正确而遭遇退货。因此，有必要开发一种实用、灵敏、特异的花生过敏原成分快速检测方法。

花生是“90年代中国食物结构改革与发展纲要”中提出的重点开发利用植物蛋白之一。随着国民饮食结构的变化，花生消费将不断增加，花生过敏发病率可能会呈上升的趋势。目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有11种[10-14]，Ara h6 是花生中的过敏原之一，属于 2S 白蛋白家族，与花生主要过敏原Ara h2 的氨基酸序列有59%的同源性[15]。Ara h6 约占花生蛋白总含量的 4.5%[16]，其分子质量约为15 ku，等电点为5～6[17]。近年来，Ara h6蛋白在花生过敏反应中的重要作用已得到越来越多的关注[18]。

检测食物中花生过敏原成分主要有2种方法，即检测花生过敏原蛋白成分和检测过敏原基因残留。其中过敏原DNA残留检测技术主要依靠各种基于PCR为基础的技术[19]。焦磷酸测序技术是基于序列合成原理的DNA序列测定技术，可以快速、准确地进行短DNA序列分析，操作简便、高通量、速度快，且重复性和精确性好，无需进行电泳，也无需荧光染色和同位素标记，结果简单易读，已被广泛应用于生物学多个相关领域。本研究建立了基于过敏原基因Ara h6的花生过敏原成分焦磷酸测序检测技术，可快速确认出食品中是否含花生过敏原成分，能够更好更快地鉴定过敏原食品标签，保证食用安全。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 试验材料

花生样品：实验室检验的花生样品和市购花生。花生酱为实验室样品；方便面、饼干、夹心饼干：自购。绿豆、豇豆、豌豆、蚕豆、芸豆、扁豆、大豆：自购。

1.1.2 引物

PCR扩增引物(上游引物Ara h6-F 5’- AAGCTGCGAGAGGCAGGTAGA-3’；下游引物Ara h6-R 5’- TTTGCCTGTCCTGCAACCTAT-3’ ，5’端标记生物素)：invetrogen公司，扩增长度239 bp。

焦磷酸测序引物(arah 6-S 5’- GCTCATCGCAGCACC-3’)：invetrogen公司。

1.1.3 PCR试剂

2×GoTaq Master Mix PCR体系：天根生化科技有限公司；500 bp DNA Ladder Marker：大连宝生物公司。

1.1.4 焦磷酸测序所需试剂

焦磷酸测序试剂盒[包括焦磷酸测序用酶、底物及各种dNTP、链酶亲和素磁珠(Sepharose beads)、绑定缓冲液(Binding Buffer)、复性缓冲液(Annealing Buffer)、变性缓冲液(Denaturation Buffer)、洗液(Washing Buffer)]：BD公司。

1.2 仪器设备

普通PCR仪(Mastercycler gradient)、离心机(5417R)、微量可调移液器(10、100、200、1 000 uL)：德国 Eppendorf 公司；电泳仪 (DYY-6C)：北京六一仪器厂；PyroMark ID检测系统：瑞典Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 模板的制备

样品处理：取花生等试验材料100 g，用灭菌洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀备用。

DNA模板的提取采用CTAB 法：取100 mg 样品于50 mL 离心管中，加入5 mL CTAB提取缓冲液和20 μL蛋白酶K溶液，充分混匀。65 ℃振荡过夜后，13 000 r/min离心20 min，转移上清液700 μL至新的离心管中；加入700 μL三氯甲烷后用力振荡，13 000 r/min离心5 min，将上清转液移到新的2 mL离心管中；加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置60 min，13 000 g离心5 min，弃去上清液。加入350 μL NaCl 溶液将沉淀进行悬浮，再加入350 μL 三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13 000 r/min离心10 min。转移上清液到新的2 mL离心管中后加入 0.8倍体积的异丙醇，室温放置60 min，13 000 r/min离心10 min，弃去上清液。加入500 μL 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于100 μL TE 溶液中，立即使用或-20 ℃保存备用。

1.3.2 PCR扩增

PCR反应体系：2×GoTaq Master Mix 25 μL，生物素标记上游引物和下游引物各10 pmoL，DNA模板2 μL，加无菌去离子水至50 μL。扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，50个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保温。取反应产物5 μL上样，2%琼脂糖凝胶电泳观察结果，其余扩增产物用于焦磷酸测序。

1.3.3 焦磷酸测序

1.3.3.1 将PCR产物转移至96孔PCR板中，在产物中分别加入Sepharose beads 3 μL和Binding Buffer 47 μL，常温混匀10 min。

1.3.3.2 打开真空泵，将磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超纯水中清洗30 s后移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分别在70%乙醇中清洗5～10 s、Denaturation Buffer中变性5 s、Washing Buffer中清洗5～10 s。关闭真空泵，将磁珠释放入96孔测序板中，该板中预先加入测序引物0.3 μmol/L和Annealing Buffer共45 μL。

1.3.3.3 将96孔测序板置80 ℃温箱2 min，冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。设定程序，碱基的加入为ATCG 6～10个重复，根据程序给定剂量(该剂量根据样本数的多少而定，由仪器程序自动给出)，在试剂舱中加入酶混合物、底物混合物以及4种dNTP，将试剂舱和96孔测序板放入机箱中进行反应。

2 结果和分析

2.1 PCR扩增引物特异性检测结果

利用设计引物扩增各测试材料的特异基因片段，电泳结果显示只有花生样品能够扩增出239 bp特异性基因片段，片段长度与引物设计的预期片段长度大小一致；绿豆、赤豆、豇豆、豌豆、蚕豆、芸豆、扁豆、大豆均无扩增条带出现(图1)，说明引物能够对花生过敏原基因Ara h6具有特异性。

注：M-DL 500 DNA Marker；1～10为花生样品；11～17分别为绿豆、豇豆、豌豆、蚕豆、芸豆、扁豆、大豆。

图1 扩增引物特异性检测

2.2 焦磷酸测序结果分析

对10个花生样品的Ara h6基因PCR扩增结果均进行了焦磷酸测序，测序结果皆为TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，具有非常好的重现性(图2)。

图2 部分花生样品Ara h6基因目的片断焦磷酸测序结果

2.3 Arah 6基因焦磷酸测序目标序列同源性分析

对测序结果在GenBank中进行同源性比对，结果表明：目标序列与花生Ara h6基因聚为一簇，能够作为鉴定花生过敏基因Ara h6基因很好的序列(表1)。

表1 Ara h6目标序列在genbank同源性比对获得的同源性基因

表1(续)

2.4 食品中花生过敏原基因DNA成分的检测

用焦磷酸测序法检测8种食品中是否花生主要过敏原基因Ara h6 DNA成分，判断该食品中是否含有花生过敏原。结果表明，8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相符(表2)。

表2 焦磷酸测序法鉴别花生过敏原成分结果

3 讨论和结论

国内食品过敏原成分检测尚处在起步阶段，还没有立法强制规定食品必须加注过敏原标签。相比之下，欧、美、日等国家和地区为了防止消费者误食食品中花生过敏原导致严重的过敏反应，近年来都制定了规范食品过敏原标签的法律法案。如2006年1月1日美国FDA就开始实施新的《食品过敏原标识和消费者保护法规》[19]；2007年5月中国香港也开始实施食品过敏原标示；我国也于2011年4月20日公布了在2012年4月实施的GB 7718—2011《食品安全国家标准 预包装食品标签通则》, 增加了食品中可能含有过敏物质时的推荐标示要求，对标注过敏物质做出了规定：如果用麸质的谷物、甲壳类动物、鱼类、蛋类、花生类、大豆类、乳制品、坚果类等做配料, 或者是加工过程中可能带入上述食物, “宜在配料表中使用容易辨识的名称, 或在邻近位置加以提示”[21]，这是我国第1个对食物过敏提出要求的食品安全管理规定。

我国食品出口企业经常因为食品过敏原标签标识不全或未真实标识而遭遇国外通报，2005年，中国因为食品标签不符合要求或者提供的信息不全面而被美国FDA通报的产品数量约占中国输美动植物类产品被通报总数的1/4，食品标签问题已成为出口食品不合格的原因之一[20]。因此，建立一种可靠、快速、灵敏、特异的过敏原成分检测方法快速鉴别是否含有进口国要求的过敏原十分必要。

花生是常见的食物过敏原之一，含有多种主要蛋白过敏原如Ara h1、Ara h2、Ara h6等。花生主要蛋白过敏原虽然耐热，但加工过程的高温处理等可能改变其空间结构，从而有可能影响基于抗原抗体特异反应；相比之下花生基因组DNA在加热、压力等处理下仍会在较长的时间内保持一定的完整性[22]，因此，检测食物中残留的花生主要过敏Arah系列基因DNA片断可作为一种有效的花生过敏原检测方法[23]，德国R-Biopharm开发了花生主要过敏原Ara h2 PCR检测试剂盒[24]。

本研究建立了基于焦磷酸测序法的花生过敏原Ara h6的DNA片段快速检测鉴定技术，结果表明，焦磷酸反应体系能够有效的对Ara h6基因进行目标片段测序，测序结果与设定完全一致，对花生成分具有特异性，检测复现性良好，为食品中的花生过敏原成分快速检测提供很好的技术支撑，保证了食品的进出口和食用安全。

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Rapid Detection of Peanut Allergens Gene Ara h6 by Pyrosequencing Technology

Fang Baohai1Jia Juntao1Zhao Liqing1Pang Guoxing2Men Aijun3Yue Zhiqin1Liang Chengzhu1Xu Biao1

(Shandong Entry-Exit Inspectiono and Quarantine Bureau and Technical Center for Inspection & Quarantine1,Qingdao 266002)(Qingdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau2, Qingdao 266000)(Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau3, Qingdao 266000)

A rapid method was established to detect peanut allergen gene Ara h6 by pyrosequencing technology. This method has a very good specificity and reproducibility. Homology comparison analysis of pyrosequencing results (namely target sequences) in GenBank showed that this sequence can be used as a signature sequences to detect peanut allergens. This technology would provide technical supports of detecting peanut allergen in food, and also could ganrantee the safety of imported and exported food.

prosequencing, peanut, allergen, Ara h6

S565.1

A

1003-0174(2016)02-0127-05

国家质检总局项目(2011K221、2006IK105、2009IK176)

2014-07-10

房保海，男，1976年出生，高级工程师，食品安全检测和风险评估