3层结构抗菌型牙槽骨修复膜的制备和检测＊

张 良，谭铭浩，阳范文，朱继翔，田秀梅，陈晓明

(广州医科大学 生物医学工程系， 广州 511436)

3层结构抗菌型牙槽骨修复膜的制备和检测＊

张 良，谭铭浩，阳范文，朱继翔，田秀梅，陈晓明

(广州医科大学 生物医学工程系， 广州 511436)

设计和制备一种适合口腔牙槽骨缺损修复的多层功能膜。利用溶液铺展法和静电纺丝法制备3层多功能膜；通过扫描电镜得到修复膜微观形貌结果，力学性能测试结果得到拉伸强度为6.5 MPa；进行模拟体液的药物释放发现释放时间可持续3 d。结果表明，3层多功能膜引入致密PCL层获得更高的机械强度，添加明胶抗菌层获得了抗菌功能。

牙槽骨修复；骨引导；屏障作用；抗菌

0 引 言

如今，口腔健康问题越来越受人们的关注，口腔问题中以牙槽骨缺损最为严重，为了恢复骨组织的正常功能，临床将引导骨再生作为重要的治疗手段，牙槽骨缺损的引导再生成为当今研究热点[1]。种植义齿，需要对牙槽骨进行病理消除和槽骨增量，这也要利用引导骨再生技术[2-3]。

在牙槽骨缺损的自我修复过程中，牙周膜细胞生长速度远大于骨细胞，这样造成牙周膜细胞长入牙槽骨缺损部位，阻碍骨组织的生长和修复[4]。通过生物工程膜对两种组织进行隔离，使牙周组织不能长入，并且引导骨细胞生长，修复骨缺损[5]。发挥隔离、引导作用的膜称为引导骨再生膜(GBR膜)[6]。

如今临床中使用的Bio-gide膜、海奥口腔修复膜等都具有双层功能体系，致密胶原层起到屏蔽隔离作用，而疏松层则引导骨细胞的生长，这些修复膜主要是动物胶原膜[7-8]。近几年研究的高分子可降解膜也采取了双层功能体系，通过材料的复合和多层化，以达到修复膜的多功能化。Marco C. Bottino等使用静电纺丝法制成多层膜，设计成三明治结构，在双层的结构上添加了消炎灭菌层，使修复膜获得抗菌功能[9]。

但是，现研究的可降解膜存在降解快、机械强度不够等问题，这类屏障膜进行牙槽骨修复时会发生膜塌陷。本文通过对致密中层结构的引入，以期能够在不增加厚度的条件下，达到更高的机械强度和合适的降解速度[10]。

1 实 验

1.1 材料与仪器

PCL，分子量8×104，深圳市光华伟业实业有限公司；明胶，阿拉丁，胶强度约250 g Bloom；纳米羟基磷灰石，阿拉丁，大于等于97%，小于100 nm；戊二醛，25%，天津市福晨化学试剂厂；六氟异丙醇，郑州阿尔法化工有限公司。

静电纺丝机，深圳通力微纳；万能电子试验机，深圳新三思仪器有限公司CMT7503；扫描电子显微镜，日本Hitachi S-3400N Ⅱ型；傅立叶红外光谱仪，布鲁克TENSOR27；超微量分光光度计，Thermo Scientific NanoDropTM2000。

1.2 3层多功能膜的设计

本文设计的膜为3层结构(图1)，中层为致密的屏障层，内层为静电纺丝制备的疏松纤维引导骨再生层，外层是纺丝纤维抗菌层。聚己内酯(PCL)可降解，其降解速度恰当，为6个月左右，其亲水性差，作为中层膜能起到有效的阻隔作用。

图1 3层多功能膜的设计图

而引导膜的内层与细胞接触，加入明胶调节亲水性使细胞能粘附生长；膜的内层与骨缺损部位接触，复合纳米羟基磷灰石(nHA)可促进骨生长。膜的外层与手术伤口接触，是易感染区，载入抗菌药物缓释，能有效控制细菌感染。

1.3 多层功能膜的制备

1.3.1 多层功能膜制备

nHA/PCL/明胶复合内层，m(明胶)/m(PCL)=1∶1的六氟异丙醇溶液中分别混入20%，50%和80%(质量分数)nHA，进行静电纺丝(静电纺丝的参数，溶液浓度5%(质量分数)，电压为8 kV，接收距离为15 cm，注射速度1 mL/h，得到纳米纤维膜。

致密PCL中层，将PCL的六氟异丙醇溶液倒在玻璃板上，并用玻璃片围住周边，晃动玻璃板使溶液尽量铺展，控制膜的最终厚度为0.04～0.06 mm。

外层明胶外层，配制5%(质量分数)明胶的六氟异丙醇溶液，进行静电纺丝获得纳米纤维膜，在该溶液加入替硝唑进行静电纺丝，可得负载药物的纳米纤维膜。

3层多功能膜，先制备PCL致密膜，再在该膜的一面通过静电纺丝制备明胶层，真空干燥24 h；最后，翻转在另一面静电纺丝制备含nHA的内层，真空干燥24 h，保存。

1.3.2 明胶纤维层的交联

将10 mL的25%戊二醛水溶液倒入培养皿中，然后将培养皿放入干燥器底部，样品膜放在干燥器的孔盘上，盖上干燥器盖子，利用蒸汽对薄膜进行交联，交联时间分为1，2和12 h等。结束后真空干燥。

1.4 性能测试

1.4.1 形貌表征

用数码照相机对样品膜表面进行拍摄取照，进行宏观观察；用扫描电子显微镜对样品膜表面微观形貌、纤维结构和样品膜的截面层状结构进行微观观察和分析。

1.4.2 亲水性和溶胀率

将水滴滴在样品膜上，60 s后照相，通过软件测定照片中水滴的高度h和水滴与膜接触面的直径d。利用式(1)得到静态接触角[11]

(1)

用电子分析天平称取0.0500 g左右的样品膜(重Ma)，浸泡在20 mL PBS液中24 h，达到溶胀平衡，然后再将样品膜取出，用滤纸轻轻擦去膜表面溶剂，迅速称重Mb。按式(2)计算溶胀率[12]

(2)

1.4.3 力学性能测试

将样品膜用磨具切割成哑铃型，并用游标卡尺测量样品细长部位的宽度和厚度。用万能电子试验机测得样品膜的拉伸力和断裂强度。

1.4.4 药物的红外分析及释放

使用红外光谱仪用透射法测得替硝唑粉末的红外光谱图，用反射法测得薄膜的红外光谱图。

取载药明胶层0.0100 g置于20 mL PBS液中， 37 ℃,60 r/min条件下进行药物释放，在前12 h每1 h取样一次，之后每12 h取样1次，持续1周， 取样时先取1 mL，再补充1 mL PBS液。最后，用超微量分光光度计对所得释放液进行药物的定量分析。

2 结果与讨论

2.1 3层多功能膜各层的宏观观察和微观显貌

图2为相同比例的PCL/明胶中，含20%，50%和80%(质量分数) nHA的纤维膜扫描电镜图。从图2比较看出，随着nHA的增加，纤维上的颗粒也在逐渐增加，而PCL/明胶含量的减少，纤维得到了更强的拉伸，纤维的直径不断减小。当nHA含量为80%(质量分数)时，可静电纺丝成纤维膜，但该纤维膜nHA过多，物理摩擦会导致磷灰石粉末脱落，不适合实际应用。nHA的含量及形貌是内层引导骨再生的关键因素，含50%(质量分数) nHA的纤维膜在含量和均匀度优于20%(质量分数)的纤维膜，因此选择含50%(质量分数)的nHA纤维膜作为多功能膜的引导骨再生层。

图2 不同nHA含量的复合纤维膜的扫描电镜图

图3为溶液铺展制备的致密PCL膜和静电纺丝法制备的纤维PCL膜的扫描电镜图。从图3可以看出，致密PCL基本没有空隙，与液体接触面积远低于纤维PCL。中层的主要功能是物理屏蔽、支撑空间，则其关键因素为机械强度，从微观结构可以判断致密PCL膜强度要大于纤维PCL膜，而且通过后续的机械性能测试也证实了此判断。

图3 不同制备方式的PCL膜的扫描电镜图

3层多功能膜的外层被设计为载药抗菌层，它在牙槽骨修复的应用中与牙周纤维组织接触。多功能膜的使用环境为水环境，需要对明胶纤维交联以避免在水中溶解，交联后的微观形貌如图4所示。明胶在没有交联时，纤维直径较小，纤维之间粘结低，但是随着交联时间的增加，交联程度增加，纤维直径有较大的增加，纤维之间粘结加强，交联12 h后，很难发现有清晰纤维。

图4 不同交联时间的明胶纤维膜的扫描电镜图

图5为3层功能膜的截面微观形貌，膜的截面厚度有120 μm，明胶抗菌外层厚度约为25 μm，致密PCL屏障中层约为60 μm，nHA引导内层约为35 μm。目前，应用中的引导膜bio-gide膜的厚度为50 μm、海奥口腔修复膜为100 μm，本文膜的厚度为120 μm，三者接近，可以判断在牙槽骨修复手术中，不会因为3层功能膜厚度引起患者的不适感。

2.2 多层功能膜各层亲水性改善及溶胀率的比较

亲水性是评价医用植入材料的指标，它关系到细胞对材料的粘附程度，一般认为亲水性好的材料表面有利于细胞粘附生长。图6(a)为PCL复合明胶改变亲水性的静态接触角图，PCL纤维膜的静态接触角为95.2°，亲水性较差；50%PCL/明胶纤维膜的静态接触角为46.7°，亲水性良好，且不溶解，可作为复合nHA的材料。图6(b)为明胶交联前后的静态接触角图，明胶无交联纤维的静态接触角为33.6°，但是水滴会在几分钟后发生溶透，明胶纤维能溶于水，不适合在口腔中使用；明胶交联12 h的纤维膜静态接触角为87.1°，亲水性较弱不利于细胞粘附；明胶交联1 h的纤维膜静态接触角为44.7°，亲水性良好，且不溶于水，达到了水环境下使用的要求。

多层功能膜作为植入材料，在水环境下的溶胀程度对患者植入后感觉有重要影响。3层多功能膜和各层膜在PBS溶液中的溶胀率大不相同，如图7所示，内层膜的溶胀率为308.2%，吸水量最高，这主要是nHA的吸水作用及静电纺丝纤维的多孔结构造成的；静电纺丝纤维PCL膜的溶胀率为199.4%，远高于致密型PCL膜的0.6%，静电纺丝的多孔结构起到主要的作用；交联1 h的电纺明胶纤维膜的溶胀率为160.2%，交联12 h的电纺明胶纤维膜为99.8%，交联作用使纤维膜中的孔隙减小，明胶的溶胀能力也减弱；PHG 3层多功能膜(中层为致密PCL，外层为交联1 h的载药电纺明胶纤维和内层为m(nHA)/m(PCL)/m(明胶)为2∶1∶1的复合纤维)的溶胀率为64.4%，其整体溶胀率不高，不会出现在植入患者后过于肿胀的现象。

图5 3层功能膜截面的扫描电镜图

图6 几种纤维膜的静态接触角(n=5)

2.3 多功能膜的力学性能

力学测试结果如表1所示，PCL致密膜强度为13.7 MPa，远大于PCL静电纺丝纤维膜的1.5 MPa；以致密PCL膜为中层的3层多功能膜强度为6.5 MPa、抗拉伸力5.2 N；也远大于3层纤维膜(中层为PCL静电纺丝纤维、内层为nHA/PCL/明胶复合静电纺丝纤维、外层为明胶载药静电纺丝纤维)的1.6 MPa和3.8 N。引入中层致密PCL膜增强了多功能膜力学强度，优化了屏障功能。

图7 几种膜在PBS溶液中的溶胀率 (n=5)

Fig 7 Swelling ratios of membranes in PBS solution (n=5)

表1中PCL致密膜两面进行静电纺丝，制备成3层多功能膜的拉伸力却下降了。这是因为3层结构为溶剂粘合，当纺丝液喷射在PCL致密膜上时，溶剂不能蒸发完全，造成了PCL膜的轻微溶解，出现溶痕、纹痕；特别是静电纺丝nHA引导骨再生层时，nHA颗粒含有大量溶剂，造成PCL致密膜众多点痕，不再平整，3层多功能膜在拉伸时有了应力点，反而更容易断裂，拉伸力和断裂生长率下降。

2.4 3层多功能膜载药的红外分析及药物释放

表1 多功能膜的力学性能

图8 负载替硝唑的明胶红外谱图

图9 替硝唑分子式

图10为替硝唑/明胶纤维膜中替硝唑7 d的累积释放曲线，从曲线上可以看出，前8 h，药物出现突释，第8 h时累积释放率已经接近50%。在12 h后，进入相对稳定的释放阶段，持续到第60 h，释放了大量药物。最后在72 h左右释放达到最大值，累计释放率达到90%，释放完毕。在口腔手术完成后的恢复过程中，前8 h阶段快速释放大量替硝唑灭杀细菌；随后在2～3 d中持续释放一定浓度的药物，起到抗菌效果；当3 d后，伤口基本愈合，不会再有细菌进入，治疗度过易感染期[14]。这种释放规律是符合手术后的愈合过程。

图10 负载替硝唑的明胶膜在PBS液中的释放曲线(n=5)

Fig 10 Release curves of gelatin membrane with tinidazole in PBS (n=5)

3 结 论

针对口腔修复膜所存在的问题，对引导骨再生膜进行了中层致密结构引入，成功制备了新型的3层多功能膜。中层致密的设计使3层多功能膜的力学强度有了很大提高，达到6.5 MPa，强化了修复膜的屏障功能。外层明胶抗菌纤维膜的替硝唑释放可持续3 d，能够满足牙槽骨修复手术的抗菌需求。3层多功能膜各层间结合良好，无间隙；各膜层的亲水性合适于细胞粘附。总体溶胀率为64.4%，并且膜的厚度为0.12 mm，能够满足人体感受要求。

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Preparation of three-layered membrane for antimicrobial and alveolar bone regeneration

ZHANG Liang，TAN Minghao，YANG Fanwen，ZHU Jixiang，TIAN Xiumei，CHEN Xiaoming

(Department of Biomedical Engineering, Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,China)

This paper design a multifunctional alveolar bone regeneration membrane. Preparation the three-layered membrane by solution spreading and electrospinning. The microstructure observation was carried out by scanning electron microscopy (SEM); the three-layered structure demonstrated higher strength (6.5 MPa); the drug release showed sustainable 3 d time. The results testified that it is promising for use in alveolar bone regeneration.

alveolar bone repair; bone guide; barrier function; antimicrobial

1001-9731(2016)12-12240-06

广东省科技计划资助项目(2013B010402019)；广东省自然科学基金资助项目(2015A030310345)；广东省医学科学技术研究基金资助项目(A2015352)

2016-03-11

2016-06-08 通讯作者：陈晓明，E-mail: xmchenw@126.com

张 良 (1989-)，男，湖南常德人，在读硕士，师承陈晓明教授，从事生物医用材料研究。

TB34

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.12.042