雷公藤红素经过TRAIL途径增强γδ T细胞对骨肉瘤细胞株HOS的杀伤作用①

李朝旭 张浚哲 王胜涛 王锐英 唐际存

(桂林医学院附属医院骨二科，桂林541004)

·中医中药与免疫·

雷公藤红素经过TRAIL途径增强γδ T细胞对骨肉瘤细胞株HOS的杀伤作用①

李朝旭 张浚哲 王胜涛 王锐英 唐际存②

(桂林医学院附属医院骨二科，桂林541004)

目的：探讨雷公藤红素经过TRAIL途径增强γδ T细胞对骨肉瘤细胞株HOS的杀伤作用。方法：Western blot检测骨肉瘤细胞株HOS死亡受体(DR)的表达。使用唑来膦酸(ZOL)联合IL-2体外扩增人γδ T细胞，LDH法检测γδ T细胞对HOS细胞株的杀伤活性。结果：雷公藤红素可促进骨肉瘤细胞株HOS死亡受体DR4和DR5的表达(P<0.05)。健康人来源的γδ T细胞具有杀伤HOS细胞株的能力(P<0.05)，经过雷公藤红素(1 μmol/L) 24 h预处理HOS细胞株，γδ T细胞杀伤HOS细胞株的能力增强(P<0.05)，TRAIL中和抗体可阻断雷公藤红素增强γδ T细胞杀伤HOS细胞株的能力(P<0.01)。结论：雷公藤红素经过TRAIL途径增强γδ T细胞对骨肉瘤细胞株HOS的杀伤作用。

骨肉瘤；γδ T细胞；免疫治疗；雷公藤红素

我们前期研究显示，γδ T细胞在体内外对骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)有一定的杀伤作用[1]。然而，肿瘤微环境中大量免疫抑制因素的存在，导致免疫效应细胞难以识别肿瘤细胞，影响了γδ T细胞免疫治疗的效果，限制了γδ T细胞的进一步临床应用。

通过药物上调肿瘤细胞表面表达的为免疫细胞所识别的特异性高亲和力受体，达到免疫细胞特异性杀伤肿瘤细胞的效果，是提高γδ T细胞免疫治疗效果的可靠途径[2]。因此，寻找不同的联合方案成为提高γδ T细胞免疫治疗OS亟需解决的问题[3]。本研究旨在观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤人OS细胞系HOS的影响及机制，为OS患者的γδ T细胞免疫治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 Daudi和人OS细胞系HOS购自中国科学院上海细胞所。唑来膦酸(Zoledronate,ZOL)、雷公藤红素为瑞士诺华制药公司产品，人重组白介素2(recombinant interleukin 2，rIL-2)、 MTT和DMSO购自上海普欣生物有限公司,CD3、TCR-γδ、死亡受体(Death receptors,DR)4、DR5和抗肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抗体购自美国eBioscience公司，淋巴细胞分离液购自加拿大Cedarlane公司，CytoTox96®非放射性细胞毒性试剂盒购自Promega公司，胎牛血清、DMEM培养基、RPMI1640干粉均购自Gibco公司，CytomicsTMFC500型流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞培养 Daudi细胞培养于RPMI-1640完全培养基，HOS细胞培养于DMEM完全培养基。

1.2.2 Western blot法检测蛋白表达 用RIPA裂解液裂解雷公藤红素处理前后HOS细胞，提取总蛋白质，用BCA法测定蛋白质浓度，等量蛋白质采用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离，然后转PVDF膜上，室温下摇动封闭2 h后，总蛋白加入鼠抗人DR4、DR5抗体4℃过夜，室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP) 耦联羊抗鼠二抗，ECL显影，以β-actin条带作为内对照。

1.2.3 γδ T细胞制备 本研究获得桂林医学院附属医院伦理委员会批准并经健康志愿者同意。γδ T细胞制备具体步骤见我们以前研究[4]。取健康人外周静脉血5 ml,1∶1稀释后,用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),RPMI1640完全培养基调整细胞密度为(1～2)×106ml,在24孔培养板(1 ml/孔)中培养,置于37℃、5%CO2培养箱;培养第1天新鲜培养液含ZOL 1 μmol/L和人rIL-2 400 U/ml;以后，每3 d更换一半新鲜培养液，内含人rIL-2 400 U/ml，共培养2周后收获γδ T细胞，分别加入抗人TCR-γδ-PE抗体和抗人CD3-FITC抗体， 避光4℃孵育30 min；流式细胞仪检测γδ T细胞的纯度。

1.2.4 T细胞细胞毒性试验及阻断试验 以HOS为靶细胞,分别设置效靶细胞比为1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1,根据CytoTox96®非放射性细胞毒性试剂盒的操作说明检测体外扩增2周的γδ T细胞细胞毒性，具体步骤见我们以前研究[5]。阻断实验，γδ T细胞在含抗TRAIL抗体(10 μg/ml)的新鲜培养液孵育半小时，PBS洗涤2次后,按6∶1的比例，与HOS细胞混合。根据以下公式计算:γδ T细胞杀伤率=(A实验组-A效应细胞对照组-A靶细胞对照组)/( A靶细胞最大释放量组-A靶细胞对照组)×100%[6]。

1.2.5 MTT法测定细胞相对活力 γδ T细胞分别以每孔1×104个细胞接种于96孔板内，37℃、5%CO2培养箱培养过夜。加入终浓度分别为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00和16.00 μmol/L的雷公藤红素，每个浓度梯度设5个复孔同时设空白和未干预对照，继续培养24 h。酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度值(A值)，计算细胞相对活力：γδ T细胞细胞相对活力=A药物/A对照×100%。重复3次。

2 结果

2.1 雷公藤红素促进HOS细胞DR4和DR5的表达 如图1所示， DR4和DR5在HOS细胞不表达或表达较弱。经不同浓度雷公藤红素预处理HOS 24 h后，HOS细胞DR4和DR5表达明显提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈剂量依赖性。

2.2 γδ T细胞对HOS细胞具有杀伤作用 4例健康人志愿者参与本研究,健康人PBMCs来源的γδ T细胞体外扩增结果见我们前期研究[6，7]。如图2所示，在效靶细胞比为1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T细胞对HOS的杀伤率分别为(3.2±1.3)%、(12.0±2.1)%、(16.7±1.9)%和(19.5±2.0)%。

2.3 雷公藤红素增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用 HOS在含1 μmol/L的雷公藤红素的完全培养基孵育24 h，观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤HOS细胞的影响。结果如图2所示，在效靶细胞比为1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T细胞对雷公藤红素预处理的HOS细胞的杀伤率达到(8.0±2.1)%、(17.3±2.4)%、(24.7±1.5)%和(36.3±1.4)%，雷公藤红素可增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用(P<0.05)。

图1 雷公藤红素对HOS细胞DR4 and DR5表达的影响Fig.1 Impact of celastrol on DR4 and DR5 expression in OS cell line HOS

图2 雷公藤红素增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用Fig.2 Celastrol sensitizes OS cells HOS to γδ T cell-mediated cytotoxicityNote:*.P<0.05 vs untreated group.

图3 TRAIL中和抗体阻断γδ T细胞对骨肉瘤细胞的杀伤作用Fig.3 Effect of a neutralizing TRAIL antibody on cytotoxic lysis of OS cells by γδ T cells

图4 雷公藤红素对γδ T细胞增殖及杀伤活性的影响Fig.4 Impact of celastrol on proliferation and cytotoxic activity of γδ T cells

2.4 雷公藤红素增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用通过TRAIL途径 为了观察雷公藤红素增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用的途径，我们使用TRAIL中和抗体，阻断γδ T细胞经过TRAIL途径对骨肉瘤细胞的杀伤。结果如图3所示，在效靶细胞比为6∶1时，γδ T细胞对未处理的HOS细胞及雷公藤红素预处理的HOS细胞的杀伤分别达到(16.7±1.9)%和(24.7±1.5)%；使用TRAIL中和抗体预先作用γδ T细胞30 min后，对未处理的HOS细胞及雷公藤红素预处理的HOS细胞的杀伤分别达到(10.7±1.0)% 和(9.7±1.0)%，两者无统计学差异(P>0.05)。

2.5 小剂量雷公藤红素对γδ T细胞活力及杀伤活性无影响 结果如图4A所示， 当雷公藤红素的浓度达到4 μmol/L时，γδ T细胞活力仍然达到(86 ± 2.3)%，提示小剂量雷公藤红素对γδ T细胞活性影响不大。为观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤活性的影响，我们选择对γδ T细胞杀伤敏感的Daudi细胞作为靶细胞，γδ T细胞在含或不含1 μmol/L的雷公藤红素的完全培养基孵育24 h后，观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤Daudi细胞的影响，结果显示雷公藤红素对γδ T细胞杀伤活性无明显影响(P<0.05，图4B)。

3 讨论

目前已知TRAIL途径是导致肿瘤细胞凋亡的主要机制之一[8],亦是γδ T细胞识别杀伤肿瘤细胞的重要途径之一[9]。TRAIL属肿瘤坏死因子超家族成员，表达于活化的T细胞,与DR4/DR5结合可选择性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有影响[10]。体外实验表明表达DR的OS细胞对TRAIL诱导的caspase-8介导的凋亡高度敏感，并且体内研究发现TRAIL可阻止肺部淋巴结播散和提高OS动物模型生存率[11]。因此，上调OS细胞表面死亡受体DR4/DR5的表达，可能促进γδ T细胞免疫治疗OS。

雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色素，分子式为C29H38O4，分子量为450。除了具有抗氧化、抗风湿、抗老年痴呆症等功效，近年来国内外研究发现雷公藤红素也具有广泛的抗癌活性。尤其重要的是，雷公藤红素可通过上调肿瘤细胞表面死亡受体DR4和DR5，进而增强通过TRAIL途径诱导肿瘤细胞的凋亡[12]，提示雷公藤红素可能致敏免疫细胞对靶细胞的杀伤作用[13]。但是，雷公藤红素能否上调OS细胞表面死亡受体DR4和DR5并被γδ T细胞识别，目前尚未见文献报道。本研究经不同浓度雷公藤红素预处理OS细胞系HOS 24 h后，HOS细胞DR4和DR5表达明显提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈剂量依赖性，提示雷公藤红素可能致敏免疫细胞对OS细胞的杀伤作用。

我们前期研究发现健康人及不同类型OS患者PBMCs经ZOL刺激可选择性高度扩增γδ T细胞[7]，尤其重要的是，这种体外扩增的γδ T细胞对OS细胞具有杀伤作用[14]。但是，本研究及我们前期研究结果表明γδ T细胞对OS细胞的杀伤作用较弱[15]。为观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤HOS细胞的影响，本研究结果显示1 μmol/L的雷公藤红素预处理HOS 24 h，可增强γδ T细胞对HOS细胞杀伤作用(P<0.05)。

为确定雷公藤红素增强γδ T细胞杀伤HOS细胞的作用途径，我们使用TRAIL中和抗体，阻断γδ T细胞TRAIL杀伤途径。结果显示，其对未处理的HOS细胞及雷公藤红素预处理的HOS细胞的杀伤作用无统计学差异(P>0.05)，提示雷公藤红素增强γδ T细胞对OS细胞株HOS的杀伤作用是通过TRAIL途径发挥作用。

为了进一步观察雷公藤红素对γδ T细胞增殖及杀伤活性的影响，我们首先采用MTT法观察不同浓度雷公藤红素对γδ T细胞增殖的影响，结果显示， 在含浓度达到4 μmol/L的雷公藤红素培养基中培养时，γδ T细胞增殖率仍然达到(86.0±2.3)%。为观察雷公藤红素对γδ T细胞杀伤活性的影响，我们选择对γδ T细胞杀伤敏感的Daudi细胞作为靶细胞，γδ T细胞在含1 μmol/L的雷公藤红素的完全培养基孵育24 h后， γδ T细胞对Daudi细胞杀伤活性无明显变化(图4B)。因此，我们认为小剂量雷公藤红素对γδ T细胞增殖及杀伤活性无影响，在本研究中我们采用1 μmol/L的雷公藤红素预处理骨肉瘤细胞系HOS。

综上所述，雷公藤红素能上调骨肉瘤细胞表面死亡受体DR4和DR5，进一步促进γδ T细胞对HOS细胞的杀伤作用，TRAIL中和抗体可阻断雷公藤红素增强γδ T细胞对HOS细胞的杀伤作用。

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[收稿2016-04-13 修回2016-05-18]

(编辑 倪 鹏)

Celastrol increases osteosarcoma cells line HOS lysis by γδ T cells through TRAIL way

LI Zhao-Xu,ZHANG Jun-Zhe,WANG Sheng-Tao,WANG Rui-Ying,TANG Ji-Cun.

Department of Orthopaedics No.2,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541004,China

Objective:To investigate whether celastrol can increase the cytotoxic activity of γδ T cells against osteosarcoma(OS) cells line HOS through TRAIL way.Methods:The death receptors 4/5 (DR4/5) protein levels in the OS cell lines HOS was investigated by Western blot analysis.Zoledronate (ZOL) was used to induce γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers.γδ T cell cytotoxicity against HOS cells was investigated by a standard lactate dehydrogenase release assay (LDH).Results:Celastrol increased DR4/5 protein expression in HOS (P<0.05).γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers showed cytotoxicity against HOS (P<0.05).Following co-culture with HOS pre-treated with celastrol (1 μmol/L) for 24 h,γδ T cells showed significantly higher cytotoxicity against HOS (P<0.05).The induction of DR4/5 molecules increased lysis of HOS by γδ T cells which was abolished by addition of a blocking TRAIL antibody.Conclusion:Celastrol can enhance γδ T cells′cytotoxic activity against OS cells line HOS through TRAIL way.

Osteosarcoma;γδ T cell;Immunotherapy;Celastrol

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.011

①本文为国家自然科学基金 (81360400)和广西自然科学基金(2014GXNSFAA118169)资助项目。

李朝旭(1977年-)，男，博士，副主任医师，主要从事骨与软组织肿瘤的生物治疗方面研究，E-mail:lizhaoxu@glmc.edu.cn。

R392.12

A

1000-484X(2016)12-1777-04

②通讯作者，E-mail:tangjicun@glmc.edu.cn。