化学发光紧密内插法快速测定饲料中的微量铬

■高向阳 王方方

（郑州科技学院食品科学与工程学院，河南郑州 450064）

铬是家畜及畜禽正常生长和代谢所必需的元素,能刺激糖原合成酶和增强胰岛素的活性[1]，并参与机体内多种营养物质的新陈代谢，提高繁殖性能，降低胆固醇含量[2],改善肉与蛋品质[3]。动物饲料中添加铬可以抗应激、调节免疫、提高瘦肉率和产仔性能[4-6]。若饲料中的铬含量不足，会造成机体内糖原生物合成缓慢以及葡萄糖含量升高。因此，研究饲料中铬的含量具有重要的现实意义。

饲料中测定铬的方法有原子吸收法[7]、分光光度法[7-8]、原子发射光谱法[9-10]等，原子吸收法和原子发射光谱法仪器昂贵，分光光度法样品灰化时间长,过程繁杂。流动注射化学发光(Chemiluminescence，CL)测定铬的含量，具有仪器操作简单、自动化程度高、分析速度快、试剂用量少、灵敏度高、精密度好、线性范围宽、检测限低等优点[11],但是若用标准曲线法定量，需配制5～7个标准系列溶液，耗时长，且存在一定的作图误差。由于标准曲线绘制时的温度、湿度、大气压、仪器等工作条件，与样品测定时常不相同，用之前绘制的标准曲线确定当前样品的测定结果，会引入一定的误差，需及时测定空白、校正或重新绘制标准曲线，麻烦、费时，给工作带来不便。目前，尚未见化学发光紧密内插法快速测定饲料中的微量铬的报道。紧密内插法也称双标准夹心法或双标准比较法[11]，该法利用浓度大（ρ1）、小（ρ2）的两个标准溶液，将待测试液（ρX）夹在其中，要求ρ1＞ρX＞ρ2。在相同条件下测定，浓度与测定信号有正比关系，依此完成定量分析。该法已在环境监测中有所阐述[12]，但用化学发光法测定食品中的铬含量未见文献报道。本文将流动注射、化学发光技术和紧密内插法结合，使各自的优点得到充分发挥，无需绘制标准曲线和测定空白溶液，工作效率大大提高，为饲料中铬的测定提供了新的分析技术，具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

551乳猪配合饲料、JD830乳猪浓缩饲料、JD888仔猪浓缩饲料，由郑州华测检测技术股份有限公司提供。

1.2 主要试剂与仪器

XT-9900A型智能微波消解仪/萃取仪（上海新拓分析仪器科技有限公司）、IFFM-E流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限责任公司）、DL-1电子万用电炉（北京市永光明医疗仪器有限公司）、雷磁PHS-3C型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

硝酸（洛阳市化学试剂厂），30%过氧化氢、EDTA（天津市致远化学试剂有限公司），盐酸（洛阳昊华试剂有限公司），氢氧化钠（天津市德恩化学试剂有限公司），98%鲁米诺（阿拉丁工业公司），氯化铬（CrCl3·6H2O，AR，北京双环化学试剂厂）。

1.25×10-2mol/l鲁米诺储备液：准确称取0.276 9 g鲁米诺于50 ml烧杯中，用0.1 mol/l NaOH溶液溶解并定容至250 ml的棕色容量瓶中，用时逐级稀释。

0.250 0 mg/ml Cr3+标准溶液储备液：准确称取0.128 1g CrCl3·6H2O于50 ml的小烧杯中，加水溶解,用盐酸调pH值至2.00，移至100 ml容量瓶,用pH值2.00的盐酸定容，用时逐级稀释。

0.1 mol/l EDTA：准确称取EDTA 3.722 4 g于50 ml的小烧杯中，加热溶解，移至100 ml容量瓶中定容。

0.04 mol/l H2O2：移取30%H2O20.40 ml于100 ml容量瓶中，加入1 ml 0.1 mol/l EDTA，用水定容至刻度。

以上试剂均为分析纯(AR)，实验所用水均为怡宝纯净水(电导率为2.86 μS/cm)，玻璃仪器用硝酸（1+5）浸泡6～8 h，用纯净水冲洗3遍后投入使用。

1.3 仪器工作条件

流动注射化学发光仪工作流程如图1所示，按说明书安装、预热、清洗管道后，在负高压450 V,增益1时，用Luminol-H2O2-Cr3+化学发光体系，按表1设定的参数运行。

图1 流动注射化学发光流程

表1 IFFM-E流动注射化学发光分析仪的参数

1.4 测定方法

1.4.1 测定原理

根据三价铬浓度与发光信号呈正比的关系，选取浓度大小不同的两个标准溶液，将试液的浓度控制在两个标准溶液之间，在完全相同的条件下进行测定，由测得的相对发光值和两个标准溶液的浓度值，按（1）式求得被测试液中铬的浓度：

式中：ρx——被测试液中铬的浓度(mg/ml)；

ρ1——高浓度铬标准溶液的浓度(mg/ml)；

ρ2——低浓度铬标准溶液的浓度(mg/ml)；

I1——ρ1的相对发光值；

I2——ρ2的相对发光值；

Ix——被测铬试液的相对发光值。

由（1）式可知，由于测定的是信号改变量所相当的浓度改变量，无需测定空白信号和绘制标准曲线，操作方便，结果计算简单，测定快速，工作效率较高。

1.4.2 测定步骤

样品于研钵中研至过60目尼龙筛，置于广口瓶中保存。称取样品0.200 0 g（称准至0.000 1 g）于消解罐中，加9 ml硝酸和1 ml 30%过氧化氢，按表2进行消解，冷却后，将消化液移至烧杯中，用少量水洗涤消解罐2～3次，洗涤水并入烧杯，加热赶酸至溶液近干后，加入45 ml水、5 ml亚硫酸微沸10 min[13]，冷却后在酸度计上用2.4 mol/l盐酸调节pH值至2.00，移至100 ml容量瓶中，用pH值2.00的盐酸稀溶液定容，混匀备用。移取5.00 ml于50.00 ml容量瓶中，用pH值2.00的盐酸稀溶液定容至刻度，混匀待测定。

表2 微波消解仪的参数设置

根据紧密内插法的测定原理，选取pH值2.00浓度为2.50×10-4mg/ml和2.50×10-6mg/ml的两个Cr3+标准溶液，与待测定试液在相同的条件下测定其相对发光值。根据（1）式，求得试液中Cr3+的质量浓度ρX。按（2）式计算样品中Cr3+的质量分数：

式中：W——样品中Cr3+的质量分数(mg/g)；

ρx——被测定试液中Cr3+的浓度(mg/ml)；

V——样品消解后定容的总体积(ml)；

m——称取样品的质量(g)。

2 结果与分析

2.1 鲁米诺溶液浓度的影响

分别移取1.25×10-2mol/l的鲁米诺储备液0.40、0.80、2.40、4.00、5.60、7.20、8.00 ml于100 ml的容量瓶中，用pH值12.45的NaOH溶液定容至刻度，摇匀后在其他条件固定不变时依次测定，结果见表3。

表3 鲁米诺浓度的影响

由表3知，相对发光值随鲁米诺浓度不断增大，当浓度大于5.0×10-4mol/l时，相对发光值增加缓慢，从节省试剂、降低成本方面考虑，选择5.0×10-4mol/l的鲁米诺溶液试验。

2.2 鲁米诺溶液酸度的影响

分别移取1.25×10-2mol/l的鲁米诺储备液2.00 ml于7个50 ml的容量瓶中，用pH值为11.00、11.30、11.60、11.90、12.20、12.50、12.80的NaOH溶液对应定容至刻度，摇匀后在其他条件不变时进行单因素试验，结果见表4。

表4 pH值对反应体系的影响

由表4知，酸度对发光体系影响较大，鲁米诺溶液pH值为11.90时，测定体系有最大的相对发光值。

2.3 待测溶液pH值的影响

分别移取0.250 0 mg/ml Cr3+标准溶液储备液50 μl于8个100 ml的容量瓶中，用pH值为1.80、2.00、2.30、2.50、2.80、3.00、3.20、3.40的稀盐酸溶液对应定容至刻度，摇匀后在其他条件不变时依次测定，结果见图2。

图2表明，Cr3+溶液pH值为2.00时有最大相对发光值。

图2 Cr3+标准溶液pH值的影响

2.4 H2O2溶液浓度的影响

鲁米诺溶液浓度为5.0×10-4mol/l（pH值11.90）时，依次用0.01 mol/l至0.14 mol/l的H2O2对1.25×10-4mg/ml Cr3+标准溶液（pH=2.00）进行测定，结果如表5。

由表5可知，H2O2溶液浓度为0.02 mol/l时，相对发光强度(即相对发光值)最大。

表5 H2O2溶液浓度的影响

2.5 检出限和定量限

在负高压820 V、增益为1，鲁米诺溶液为5.0×10-4mol/l（pH值11.90），对1.25×10-2μg/ml的Cr3+标准溶液（pH值2.00）进行11次平行测定，结果见表6。

表6 检出限、定量限的测定结果

由表6可知，按三倍标准偏差计算铬的检出限为0.83 ng/ml，按十倍标准偏差计算铬的定量限为2.77 ng/ml。

2.6 标准曲线的绘制

准确移取 2.50 μg/ml的Cr3+标准溶液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、10.00 ml，分别置于9个100 ml容量瓶中，用pH值2.00的稀盐酸溶液定容至刻度，分别配制成0.000、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100、0.125、0.150、0.250 μg/ml的系列标准溶液，在完全相同的条件下依次测定。以扣除空白后的相对发光值为纵坐标，以Cr3+标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线。结果见图3。

由图3可知，线性回归方程为y=1 177.2x-81.492，相关系数r=0.999 0，线性关系良好。

图3 铬的标准曲线

2.7 加标回收率

选择乳猪浓缩饲料JD830为样品，向样品中分别加入0.50、2.00、10.00 ml的2.50×10-6mg/ml Cr3+标准溶液，按照测定方法进行回收率试验，结果见表7。

表7 加标回收率

由表7结果表明，加标回收率在94.4%～104.0%之间。

2.8 对照测定结果及精密度

在优化条件下，分别用标准曲线法和紧密内插法对同一样品各进行3次平行测定，检验无可疑值后取平均值报告，同时计算标准偏差S和相对标准偏差RSD,结果见表8。

根据表8所得数据，对两种方法进行显著性检验[14]可知，两种方法的精密度无显著性差异，也不存在显著的系统误差，结论的置信度为95%。

表8 两种方法的比较

3 结论

将微波快速溶样技术、流动注射化学发光技术与紧密内插分析方法结合，使他们的优点得到了充分发挥。采用该方法定量测定饲料等生物样品中的铬含量，无需绘制工作曲线和测定空白溶液，具有操作简便、成本低廉、快速灵敏、结果计算简单的显著优点，方法的检出限为0.83 ng/ml，定量限为2.77 ng/ml，加标回收率在94.4%～104.0%之间，相对标准偏差RSD≤1.30%。与标准曲线法对照测定，在置信度为95%时，通过F检验和T检验表明，两种方法的测定结果间不存在显著的偶然误差和系统误差，为饲料中的铬提供了一种简便、新颖、灵敏、准确的测定方法，有一定的推广应用和科学参考价值。