沙棘叶中科罗索酸浓缩物的测定方法

张璐，田晓东，王斌，张琼姝，张吉科，郭海利，张小民

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

沙棘叶中科罗索酸浓缩物的测定方法

张璐1，田晓东1，王斌1，张琼姝1，张吉科2，郭海利2，张小民1

（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

对沙棘叶中科罗索酸的浓缩和提取方法进行了初步探究，提出了沙棘叶中科罗索酸含量的测定方法。结果显示，最佳提取方法是水-乙醇提取法，提取率为0.8%；提取物测定的色谱条件为：20RBAXSB-C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（体积比为88∶12）为流动相，检测波长为215 nm，流速为1 mL/min，柱温为30℃；科罗索酸在0.042 6～0.852 0 mg/mL范围内，峰面积与浓度有着良好的线性关系，平均回收率为105%，相对标准偏差（RSD）为1.75%（n＝5）。该提取方法简便、安全、无有机物残留，适合于工业生产；测定方法准确、重复性好，可用于沙棘叶提取物的含量测定和质量控制。

沙棘叶；HPLC；科罗索酸

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋溜、酸刺、黑刺，属于胡颓子科（Eleaeagnaceae）酸刺属，是世界上公认的珍贵药食同源植物。其含有428种营养物质，被誉为血管的清道夫、心脑血管的克星等。目前，大多研究集中在对沙棘果实的研究利用上，用果实加工成的饮料、食品、保健品、药品也越来越多[1]。对沙棘叶生物活性物质的研究主要是集中在黄酮类[2]、多酚类[3]、绿原酸[4]、多糖类[5]等物质上，而对沙棘叶中科罗索酸的提取和浓缩研究尚属空白。

科罗索酸（corosolic acid）又名2α-羟基熊果酸，是一种五环三萜类化合物，为熊果酸的衍生物。近年来，研究表明，科罗索酸具有降血糖、减肥、抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病等药理作用。尤其是其较好的降血糖活性，具有类似胰岛素的作用，被称为“植物胰岛素”[6]。目前，研究较多的是从大花紫薇[7]、枇杷叶[8]、山茱萸[9]中提取分离科罗索酸。姚凌云等[10]从沙棘叶中检测到科罗索酸。吴哲等[11]首次通过高效液相色谱法测定了科罗索酸的含量。

基于前人的研究，考虑到沙棘叶具有产量大、易收集、采集周期长、易贮藏等天然优势，本试验首次以沙棘叶为原料进行科罗索酸的浓缩、提取和分离，并通过高效液相色谱法测定其提取物中科罗索酸的含量，旨在为沙棘叶提取物的质量控制及制剂的开发提供有效的测定方法，为进一步开发沙棘药品和沙棘保健品提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

沙棘叶购自山西金科海生物科技有限公司，烘干、粉碎后过0.18 mm筛备用。科罗索酸（纯度98%）对照品购自上海诗丹德生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件色谱柱：20RBA×SB-C18（4.6mm× 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶0.1%冰醋酸＝88∶12；流速为1 mL/min；检测波长为215 nm；柱温为30℃；进样量为10 μL。

1.2.2 供试样品的制备将采集的沙棘叶烘干，在高速粉碎机里粉碎成粉末，过0.18 mm筛。样品1.称取一定量的沙棘叶粉末，用滤纸包好直接放入索氏提取器内，加入适量的甲醇加热回流至基本无色。将提取液经旋转蒸发仪旋转浓缩后，得到浸膏，烘干备用。样品2.称取一定量的沙棘叶粉末，置于装有回流冷凝器的圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇，90℃加热回流3 h，趁热过滤，滤液经旋转蒸发仪旋转浓缩后，得到浸膏，烘干备用。样品3.称取一定量的沙棘叶粉末，在60℃条件下水提2次，过滤，将滤液倒掉，将滤渣烘干后放入装有回流冷凝器的圆底烧瓶中，90℃无水乙醇加热回流3 h，趁热过滤，滤液经旋转蒸发仪旋转浓缩后，得到浸膏，烘干备用。

1.2.3 对照品溶液的制备精密称取干燥至恒质量的科罗索酸20.3 mg，用甲醇超声溶解后定容至25 mL，即得浓度为0.852 mg/mL的科罗索酸对照品溶液。

1.2.4 样品溶液的制备精密称取沙棘叶甲醇提取物（样品1）、沙棘叶乙醇提取物（样品2）以及沙棘叶水-乙醇提取物（样品3）各3 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL石油醚（30～60℃）浸泡40 min，浸泡2次。倾去石油醚，烘干，之后用甲醇冷浸超声提取2次，每次25 mL，冷浸30 min，超声40 min，合并提取液，过滤，滤液转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。取适量用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。

1.2.5 标准曲线的建立精密称取科罗索酸对照品21.3 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理10 min使其溶解，放冷，稀释至刻度，摇匀；再精密量取0.5，3，5，7.5，10mL对照液，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液20 μL注入液相色谱仪中测定，记录色谱图的峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，得到线性方程：y＝5 043.616 2x＋103.287 6（R2＝0.998 5（n＝5）），科罗索酸在0.042 6～0.852 0 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.2.6 稳定性试验精密吸取样品1溶液20 μL，分别在0，2，4，8，10 h按1.2.1色谱条件进样检测，确定试验稳定性。

1.2.7 精密度试验取质量浓度为0.852 mg/mL对照品溶液20 μL，连续进样6次，计算峰面积，考察仪器的精密度。

1.2.8 重复性试验取同一批次样品2粉末3 g，共5份。按照1.2.4条件制备样品溶液，按照1.2.1色谱条件进行检测，测试该方法的重复性。

1.2.9 加样回收试验称取已知含量样品2粉末5份。每份加入对照品溶液3.34 mL（0.852 mg/mL）。按照1.2.4方法制备供试液，在1.2.1色谱条件下进样检测科罗索酸的含量。

2 结果与分析

2.1 稳定性和精密度

稳定性试验在10 h之内含量测定相对标准偏差为0.91%，表明供试样品溶液稳定性较好，可以满足样品测试要求。精密度试验中含量测定相对标准偏差为0.62%，说明仪器精密度良好。

2.2 重复性和回收率

重复性试验中测得科罗索酸的平均含量为0.198 8%，相对标准偏差为0.954%（表1）；经过试验，测得加样回收率平均为105%，相对标准偏差为1.75%（表2）。

表1 重复性试验结果

表2 加样回收试验结果

2.3 样品含量的测定

按1.2.3，1.2.4条件制备对照液和样品供试液，在1.2.1色谱条件下测试，结果表明，沙棘叶甲醇提取物科罗索酸含量为0.23%，沙棘叶乙醇提取物科罗索酸含量为0.19%，沙棘叶水-乙醇提取物科罗索酸含量为0.8%。对照品及样品色谱图如图1～4所示。

3 讨论

沙棘含有丰富的生物活性物质，具有降血压、降血脂、抗氧化等多种药理作用，而且山西作为沙棘资源大省，对沙棘进行更深层次的研究与开发具有重要的意义。降血糖因子科罗索酸为一种天然五环三萜酸，其不溶于水，易溶于热乙醇、甲醇、乙酸乙酯、甲醛等有机溶剂。其在植物中的含量普遍很低。沙棘叶中科罗索酸含量为0.06%，在其含量较高的枇杷叶中仅为0.5%。贺建荣等[12]以其含量较高的枇杷叶为原料，通过水煮→低醇除杂→甲醇提取→活性炭脱水→过滤→浓缩等一系列的步骤得到三萜酸粗品，其科罗索酸含量为4.66%。陈剑锋[13-14]也通过一系列的方法从枇杷叶中分离提取了科罗索酸。但其提取工艺都较为复杂，生产成本高，不利于工业化生产。本研究参考前人的研究，以甲醇和乙醇为提取剂通过3种方法对沙棘叶中的科罗索酸进行提取，测得甲醇提取物中科罗索酸含量为0.23%，乙醇提取物中科罗索酸含量为0.19%，甲醇提取物中的含量略高于乙醇，考虑到甲醇有毒且在提取物中的残留，故选择用乙醇作为提取剂，通过水煮先去除水溶性物质，然后再用乙醇提取，含量为0.8%。舒群等[15]研究表明，科罗索酸为20 mg/kg对糖尿病大鼠有治疗作用，如果折算成人的剂量，则沙棘叶提取物中科罗索酸的含量达到1%便具有治疗效果，本研究采用水煮→乙醇提取的方法，科罗索酸提取率达到0.8%。该提取方法简单、安全、成本低，为沙棘降糖保健品的开发及工业化生产奠定了基础。

此外，本试验采用甲醇-水-冰醋酸体系为流动相，试验过程中适当降低了有机相的比例，达到了较好的分离。紫外光区在200～400 nm进行扫描，测得最大吸收波长为215 nm，故选用215 nm作为检测波长。该方法简单易行、定量准确，可作为沙棘叶提取物中科罗索酸含量的测定方法。

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［14］陈剑锋.从植物中提制科罗索酸的方法：福建，CN101274953 [P].2008-10-01.

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Method for Determination of Corosolic Acid Concentration in Seabuckthorn Leaf

ZHANG Lu1，TIAN Xiao-dong1，WANG Bin1，ZHANG Qiong-shu1，ZHANG Ji-ke2，GUO Hai-li2，ZHANG Xiao-min1
（1.College of Life Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Jinkehai Biological Technology Co.Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The concentration and extraction method of corosolic acid in the seabuckthorn leaves was explored preliminarily and the assay method of corosolic acid content from the seabuckthorn leaves extractive was proposed in this paper.The results showed that the best extraction method was water-ethanol extraction method,the extraction rate of0.8%.Chromatographic condition for the determination of extracts:20RBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was adopted.The mobile phase was methanol-0.1%acetic acid aqueous solution（88∶12）.The detection wavelength was set at 215 nm,flow rate was 1.0 mL/min,column temperature was 30℃.The concentration of corosolic acid was linear in the range of 0.042 6-0.852 0 mg/mL and the front area and concentration had good linear relationship.The average recovery rate was 105%and the RSD was 1.75%（n＝5）.The method was simple,safe,non-organic residue,it could be used for industrial production.Measuring method was accurate,reproducible,and it could be used for the determination and quality control of sea-buckthorn leaves extract.

seabuckthorn leaves;HPLC;corosolic acid

R284.2

A

1002-2481（2016）01-0030-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.01.09

2015-09-25

张璐（1990-），女，山西灵石人，在读硕士，研究方向：沙棘属植物化学与药理。张小民为通信作者。