脐带间充质干细胞培养的研究进展

冯可欣 詹昱 曲佳 巫进明 陈玲珍 杨郁青 谭明珠 陈燕梅 谭雪芳 罗英

脐带间充质干细胞培养的研究进展

冯可欣 詹昱 曲佳 巫进明 陈玲珍 杨郁青 谭明珠 陈燕梅 谭雪芳 罗英

目的观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养, 并用流式细胞仪监测脐带表面抗原及细胞周期, 探讨脐带间充质干细胞在组织工程及再生医学领域应用的优势。方法取正常足月新生儿脐带近胎儿端, 剔除动静脉, 取其中的间质成分, 双酶法消化, 从而得到原代细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞, 采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原表达情况。结果从脐带培养的间充质干细胞呈成纤维状细胞形态, 表达间充质干细胞相关抗原CD105、CD44、CD13、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45, 不表达内皮细胞抗原CD31, 与骨髓间充质干细胞表型一致。结论脐带来源的间充质干细胞可在体外培养、扩增, 具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物形态和抗原表型, 为细胞治疗探索出的新的来源。

脐带；间充质干细胞；细胞培养；免疫表型；多向分化免疫调节

间充质干细胞是一种起源于中胚层的成体干细胞, 其具有自我更新和多向分化能力, 近年来成为研究的热点。既往间充质干细胞主要来源于骨髓, 但随着年龄的老化, 间充质干细胞逐渐减少, 增殖分化能力大大减退, 取材对供者有所损伤, 限制了骨髓间充质干细胞的应用。寻找一种新的可替代来源成为迫切要解决的问题。目前, 人脐带间充质细胞已经在癌症［1］、心脏病、糖尿病［2］、神经疾病［3］等动物实验中证实有良好的治疗效果。从脐带里提取出间充质干细胞并进行体外培养、扩增、生物学鉴定, 为间充质干细胞的应用提供新的来源。

1 材料与方法

1. 1材料来源 取健康足月新生儿脐带组织, 在胎儿出生12～24 h内进行进一步处理。

1. 2方法 采用无菌的PBS冲洗脐带表面, 以清除多余的血液, 将脐带剪至3～5 cm小段, 剖开脐带, 去除脐带中的血管、内皮, 将脐带组织剪碎成约1 mm2小块, 经配制的0.2%胶原酶Ⅰ(美国Sigma公司)消化过夜, 次日再予0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)消化1 h, 经离心洗涤收集细胞, 取样做单个核细胞计数, 按1×105/cm2密度将组织接种到新的有完全培养基(美国Stemcell公司)的75 cm2塑料培养瓶(美国Corning公司)中, 置于37℃、5% CO2培养箱中培养, 4～5 d后全换液去除非贴壁细胞, 此后2～3 d半量换液1次, 至贴壁细胞融合至80%, 予0.25%胰酶消化, 收集悬浮细胞后按1∶4传代。传代至第三代后收集贴壁细胞, 应用流式细胞术进行CD44、CD105、CD29、CD34、CD45(荧光标记鼠抗人CD44-FITC、CD105-PE、CD34-PE、CD45-FITC)表面抗原检测。

2 结果

2. 1脐带间充质干细胞的形态 采用本方法获得的原代细胞多于24 h内贴壁, 倒置显微镜下可见贴壁细胞呈梭形, 部分聚集成簇, 7～14 d细胞达80%融合, 经胰蛋白酶消化传代后12～24 h内贴壁, 观察此时为呈较均一的平行排列或旋涡状的长梭形细胞, 7～10 d细胞融合至80%～90%, 继续传代至第十代, 细胞形态无明显改变。

2. 2脐带间充质干细胞的免疫表型特征 流式细胞检测结果表明, 贴壁细胞表达CD105、CD44、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45, 可从脐带分离出来的贴壁细胞为间充质干细胞。

3 讨论

目前, 间充质干细胞已成为近年来干细胞生物学领域中重要的研究方向。随着研究的深入, 发现间充质干细胞具有自我更新和多向分化能力, 同时产生的微环境对造血干细胞的归巢和细胞增殖分化均具有重要意义。2000年, Rrices等［4］首次报道了脐带血中可以分离培养出间充质干细胞, 随后Ro.nlanov等又分别从脐静脉内皮和内皮下、脐带Whartong胶质和血管周围组织中分离培养出了间充质干细胞, 并建立了脐带间充质干细胞的分离培养方法。许多研究表明不同组织来源的间充质干细胞同时又具有相似的免疫表型特征［5］, 表现为SH2(CD105)、SH3(CD73)、SH4、CD166、CD13、CD29、CD44等粘附分子阳性, 不表达造血和内皮标记, 如CD34、CD31和CD45等。表达HLA-I, 不表达HIA-DR, 不表达协同刺激分子CD80、CD86和CD40。

现已发现可在胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪获得间充质干细胞且各种来源的细胞之间无明显差异, 都具有向多种中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力, 在一定条件下, 可被诱导分化成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞和内皮细胞［6,7］。其次, 间充质干细胞独特的细胞增殖分裂模式使外源基因易于导入和表达, 因此, 间充质干细胞是潜在的基因治疗靶细胞。早期主要使用骨髓来源的间充质干细胞, 但存在以下的缺点：细胞增殖能力随供者年龄增加而减弱；骨髓采集对供者而言为有创性的操作, 难以进行大规模的推广。为此寻找新的可替代间充质干细胞供源显得十分迫切。采用本实验方法得到的间充质干细胞经鉴定具有与骨髓来源的间充质干细胞相似形态特点与免疫表型标记。本实验发现的贴壁细胞呈长梭形, 较均一的平行排列或旋涡状,均表达CD105、CD44、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45。相比于骨髓, 脐带间充质干细胞具有以下优势：脐带的获得更容易, 对供者无创伤；脐带中间充质干细胞免疫原性更低, 不表达与移植排斥相关的HLAⅡ类抗原, 也不表达由效应T细胞诱导的共刺激分子, 混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制, 异体移植该细胞不会发生免疫排斥反应［8-10］, 受者排斥可能性小；人脐带中分离出的间充质干细胞在细胞含量、增殖能力上均优于骨髓间充质干细胞, 可在体外大量扩增［11,12］；④在胎盘屏障保护下, 脐带病毒或细菌感染机会更小；⑤不牵涉伦理道德等问题。在组织工程及再生医学领域, 问充质干细胞作为种子细胞可应用于修复替代受伤或病变的多种组织器官, 从而为目前一些无法有效治愈的重大疾病如脊髓受伤、多发性硬化(MS)、老年性痴呆、帕金森氏症等提供了崭新的治疗方案。此外, 间充质干细胞的免疫调节、免疫抑制功能尤其值得关注。

［1］ Ben-Ami E, Berrih-Aknin S, Miller A. Mesenchymal stem cells as an immunomodulatory therapeutic strategy for autoimmune diseases. Autoimmun Rev, 2011, 10(7):410-415.

［2］ Kadam SS, Tiwari S, Bhonde RR. Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Animal, 2009, 45(1):23-27.

［3］ Harichandan A, B ü hring HJ. Prospective isolation of human MSC. Best Practice & Research Clinical Haematology, 2011, 24(1):25.

［4］ Rrices A, Conget P, Minguell JJ. Mesenchymal progenitic or cells in human umbilical cord b1ood. Br J Haematol, 2000, 109(1):235-242.

［5］ Minguelle JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells. BiolMed, 2001, 226(4):507-520.

［6］ 王菲, 周洪, 郭昱成, 等. 原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究. 中国组织工程研究, 2014, 18(19):3042-3047.

［7］ 范存刚, 张庆俊, 韩忠朝. 人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的研究. 中华神经外科杂志, 2005, 21(7):388-392.

［8］ 薛美思, 刘毅. 脐带间充质干细胞在细胞治疗中的研究进展.中国美容医学杂志, 2008, 17(9):1405-1407.

［9］ 郑志娟, 庄文欣, 付文玉. 人脐带间充质干细胞的研究进展.解剖科学进展, 2008, 14(1):100-104.

［10］ 迟作华, 张洹. 脐带血间充质干细胞的研究进展. 国际生物医学工程杂志, 2006, 29(1):29-34.

［11］ 马锡慧, 冯凯, 石炳毅. 人脐带间充质干细胞生物学特性及其研究进展. 中国组织工程研究, 2011, 15(32):6064-6067.

［12］ 杨文成, 董有海. 人脐带间充质干细胞的研究进展. 组织工程与重建外科杂志, 2010, 6(5):292-294.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.13.114

2017-04-11］

510620 广东省广州市第十二人民医院血液内科