水牛瘤胃微生物研究进展

梁停停，刘文丽，许浩，申立泉，李翔，马立保(华中农业大学动物科技学院，武汉 430070)

水牛瘤胃微生物研究进展

梁停停，刘文丽，许浩，申立泉，李翔，马立保
(华中农业大学动物科技学院，武汉 430070)

反刍动物瘤胃微生物在饲料降解过程中发挥着重要作用。水牛与其他品种牛相比具有耐粗性的优势，推测其瘤胃内可能含有更高效的特殊的微生物系统，能为水牛的耐粗性提供保障。另外，通过日粮对瘤胃微生物群落的调控，可以了解瘤胃微生物与日粮之间的关系，从而为改善瘤胃系统、充分利用饲料资源、提高反刍动物生产性能提供理论依据与数据支持。

水牛；瘤胃微生物；日粮；耐粗性

反刍动物瘤胃被认为是一个重要的天然发酵罐，可以为反刍动物提供发酵终产物，比如挥发性脂肪酸（VFAs）和微生物蛋白等能量物质和蛋白质。瘤胃发酵的效率越高，所合成的发酵终产物越好。瘤胃微生物是迄今为止已知的降解转化植物纤维素类物质效率最高的天然体系，依赖瘤胃微生物群体的协同作用，可将天然纤维类物质快速降解转化成一系列动物所需营养物质。瘤胃微生物每天消化的量占采食总碳水化合物的50%～55%，因此瘤胃微生物在反刍动物的饲料消化过程中起着重要的作用。瘤胃微生物包括细菌、原生虫和厌氧真菌。以细胞数量计，瘤胃微生物数量约为反刍动物自身细胞数目的10倍。每克瘤胃内容物中含细菌109～1010、原生虫105～106、真菌105个菌体形成单位（thallus-forming units,TFU）[1]。动物本身并不能分解纤维类物质，需要完全依赖栖居在其消化系统中的大量微生物。因此反刍动物最本质的问题是瘤胃微生物的问题，瘤胃微生物群落的组成对于反刍动物充分利用饲料资源有重大影响。

水牛是热带、亚热带地区特有的畜种，主要分布于亚洲地区，约占全球饲养量的90%，被国际粮农组织(FAO)认为是最具有开发潜力和价值的家畜[2]。水牛具有乳、肉、役多种经济用途，饲养方便，养殖成本低，多饲喂农作物剩余物和工业副产品等低质粗饲料，这些饲料原料含有高含量的木质纤维素、低水平的可发酵碳水化合物和优质蛋白质。与其他品种牛相比，水牛具有耐粗性高的生物学特性[3]。但到目前为止，水牛比其他品种牛消化能力强的原因还未被完全阐明，可以推测它们的瘤胃体系与其他品种牛有一定差异，可能具有更高效的特殊的瘤胃微生物体系。本文查阅了国内外研究的相关文献，现综述如下。

1 水牛与其他品种牛瘤胃微生物差异性的对比

Wanapat报道，沼泽型水牛与肉牛在瘤胃发酵和饲料营养物质消化率的水平上有显著的差异，沼泽型水牛能够更有效地利用粗饲料，特别是在供应低品质的饲料时，饲料消化率高出其他品种牛2%～5%[4]。2000年研究发现，这可能是因为沼泽型水牛的瘤胃生态系统不同于肉牛，特别是瘤胃细菌属于500多个不同的种类，其含有更高数量的纤维素分解菌和真菌游动孢子及较低的原虫数量，且对瘤胃中氮循环利用有较强的能力[5]。Wora-anu对肉牛和水牛做了对比试验，使用尿素溶液浸泡的稻草和木薯干草作为粗饲料原料，发现水牛瘤胃的总活菌数显著高于肉牛，分别为4.4x1012cells/ mL和3.6x1012cells/mL。原虫数量也高于肉牛，分别为2.3x105cells/mL和1.6x105cells/mL。丙酸和丁酸的浓度同样高于肉牛，分别为22.3vs19.4mol/100mol和15.7vs13.5mol/100mol[6]。Pant对印度水牛和瘤牛在相同的饲养管理条件下饲喂相同的日粮，结果发现，水牛瘤胃液总细菌数浓度每天平均为25.5×109cells/ mL，瘤牛为21.8×109cells/mL，前者显著高于后者。特别是季氏颤螺核菌一类微生物(Oscillospira)比瘤牛多10～25倍，每天平均浓度分别为10.46×105cells/ mL和0.56×105cells/mL。但是，总纤毛虫数量在这两个品种牛中没有差异。另外，水牛瘤胃液中细菌氮浓度高于瘤牛，瘤牛瘤胃液中的原虫氮浓度高于水牛。水牛瘤胃液中的细菌氮含量较高，并且含有较多的嗜碘微生物（颤螺菌属），表明水牛瘤胃微生物具有更高的蛋白质合成能力[7]。Wanapat对比研究水牛（印度水牛）和黄牛（婆罗门牛x本地牛）瘤胃中的原虫、真菌游动孢子和细菌时发现，水牛瘤胃中总细菌的数量高于黄牛（分别为1.6×108cells/mL和1.36×108cells/mL），且含有更高数量的球菌、杆菌和椭圆型菌。水牛含有相对较低数量的原虫，而黄牛却含有相对较低数量的holotrichs和entodiniomorphs。水牛瘤胃中真菌游动孢子的数量显著高于黄牛，分别为7.30×106cells/mL和3.78×106cells/mL。并且发现厌氧鞭菌属（Anaeromyces）和Acuminate apex是水牛瘤胃中的优势菌。这些差异可能揭示了在没有青草的旱季，水牛相比黄牛能够保持较好体重的原因[8]。Chanthakhoun研究发现，水牛瘤胃中分解纤维的微生物数量显著高于黄牛，并且在喂食4h后，水牛瘤胃中R. Albus显著高于黄牛，而F. Succinogenes的含量在黄牛瘤胃中较高。白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus，R. Albus）和F. Succinogenes是目前认为在瘤胃中最主要的纤维素分解菌，这可能是水牛对稻草具有较高消化率的原因[9]。Shuli Yang通过克隆和测序大额牛和沼泽型水牛瘤胃细菌16S rRNA基因序列库，与数据库中荷斯坦牛的细菌16S rRNA基因序列库进行对比，证明不同种类动物瘤胃细菌的系统发育具有多样性。研究共收集470个序列（236 OTUS），其中水牛173个序列（101 OTUs），荷斯坦牛150个序列（76 OTUs），大额牛147个序列（86 OTUs）。通过这三种牛的基因库比较，发现在水牛的序列中，13.3%的序列为已培养细菌的序列，而荷斯坦牛为24%，大额牛为9.5%。在已培养的细菌中，略紫色梭菌（Clostridium puniceum）、双孢梭菌（Clostridium disporicum）、Oscillospira guilliermondii、Schwartzia succinivorans、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、Planococcus sychrotoleratus、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）、硫氧化细菌（Sulfideoxidizing bacterium）、溶纤维真杆菌（Eubacterium c e l l u l o s o l v e n s）仅存在于水牛序列中；Succiniclasticum ruminis、Pseudobutyrivibrio ruminis为三者共有的序列；溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）为水牛和大额牛共有；生黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）为水牛和荷斯坦牛共有。瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis） 属于纤维分解菌，琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）可以将琥珀酸酯转化为丙酸酯，从中获得代谢能，这两种菌出现在三种牛瘤胃中，显示出对宿主的重要性以及与宿主的共生关系。Prevotella ruminicola是模拟瘤胃环境中最多的细菌之一，但是在大额牛和沼泽型水牛中未检索到相似的序列。在未培养的OTUs，2个OTUs出现在三个不同品种牛的基因库中，16个OTUs出现在其中两个基因库中，表明未培养的细菌在不同的瘤胃生态系统中存在差异。另外发现一些以前没有被描述过的动物特定细菌，比如大额牛中的Allisonella histaminiforman，沼泽型水牛中的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）。这些数据说明不同品种牛瘤胃细菌的群落的组成具有一定的差异性[10]。

Wanapat将水牛瘤胃内容物转移到肉牛瘤胃中，转移后14d发现肉牛的瘤胃生态发生了变化，瘤胃中纤维素分解菌、蛋白质水解菌和淀粉分解菌显著增加。说明通过将水牛瘤胃内容物转移给其他反刍动物可以提高其瘤胃消化率，但有关这方面的研究报道较少，在改善瘤胃生态方向，特别是以水牛为基础的瘤胃生态还需进一步研究[11]。

2 饲料对水牛瘤胃微生物的组成及数量的影响

瘤胃微生物的群落结构是持续变化的，易受到日粮、季节、宿主健康和环境温度湿度等多种因素的影响。对于健康生长的反刍动物来说，日粮是影响瘤胃微生物群落结构最重要的因素[12]。由于日粮对瘤胃微生物生存、繁衍的重要作用，因此，研究日粮对瘤胃细菌种群的影响意义重大。

Chanjula发现以稻草为基础日粮，增加木薯干草含量，可以显著降低水牛瘤胃原虫数量，每克瘤胃内容物原虫数量从6.2x105CFU降低到2.1x105CFU，而纤维素分解菌数量呈现增加趋势，从5.3x107CFU/g增加到7.2x107CFU/g ，出现这种结果的原因可能是木薯干草高含量的蛋白质（25%）和浓缩的单宁(4%)[13]。Wanapat发现与木薯片相比，玉米棒作为能量来源可以增加水牛瘤胃的活菌数，特别是纤维素细菌数量[14]。Chanthakhoun在水牛饲喂稻草的基础上补充绊牛豆干草，发现饲喂量为600g/d时，可以使细菌和真菌游动孢子的数量达到最大化，并降低原虫数量。进一步研究发现，补充绊牛豆干草可以增加纤维素分解菌产琥珀酸拟杆菌(F. succinogenes)、生黄瘤胃球菌（R.flavefaciens）和白色瘤胃球菌（R. albus）的数量，在晨饲4h之后，纤维素分解菌 R. flavefaciens和R. albus高于晨饲前。R. flavefaciens 和 R. albus 这两种细菌在水牛瘤胃中的高含量，进一步证明了水牛对高纤维饲料的高效利用率[9]。Wanapat发现在不同的粗饲料和精饲料的比例条件下，水牛瘤胃消化物和瘤胃液中F.succinogenes数量最多，其次为R. flavefaciens 和 R.albus。说明这三种细菌在水牛瘤胃中起着重要的作用[15]。Pitta利用16S rRNA焦磷酸测序方法，研究了三种精粗比日粮（50%精料:50%粗饲料，25%精料:75%粗饲料，100%粗饲料）条件下水牛瘤胃细菌的多样性，结果显示，瘤胃球菌属(Ruminococcus)和瘤胃纤维杆菌属(Fibrobacter)数量在100%粗饲料组中显著多于另外两组，普氏菌属(Prevotella)在50:50组中数量最多。Prevotella主要参与半纤维素的降解，Ruminococcus 和Fibrobacter主要参与纤维素的降解[16]。李萍对15头杂交母水牛分别饲喂精粗比为0:10、3.5:6.5、5:5的试验日粮，研究不同日粮精粗比对后备杂交母水牛瘤胃主要纤维降解菌数量的影响，结果表明随着日粮精料水平的升高，瘤胃中原虫数量逐渐增多，产琥珀酸丝状杆菌和丁酸弧菌数量逐渐降低，白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌数量差异不显著，但是呈下降趋势，说明不同日粮精粗比能有效影响杂交后备母水牛瘤胃内纤维降解菌数量，且数量随着精料水平的升高而降低[17]。周祥研究了3种不同NDF水平（38%、44%、51%）日粮对杂交水牛瘤胃细菌群落结构和一些主要功能菌数量的影响，发现在不同NDF水平日粮条件下，杂交水牛瘤胃固相与液相细菌群落区系都显示出了一定的差异性，但差异性并不显著。另外发现，在不同NDF水平日粮条件下，拟杆菌门与厚壁菌门均为瘤胃内的优势菌群。在杂交水牛瘤胃液相细菌区系中，当NDF水平为 44%时，瘤胃内瘤胃球菌属(Ruminococciis sp.)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)与另两组存在差异。在杂交水牛瘤胃固相细菌区系中，当NDF水平为38%时，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae) 较另外两组有差异。进一步的研究发现，反刍兽新月单胞菌受到日粮NDF水平的影响，当NDF水平为44%时，其数量最多。纤维降解菌（产琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌）数量在各NDF水平下未产生显著性差异，但高NDF水平组数量高于另外两组。不同NDF水平下脂解厌氧弧菌数量未受到影响[18]。

关于饲料对水牛瘤胃微生物群落影响的研究，大部分学者仍侧重于与粗纤维相关的微生物，这可能与受关注度越来越高的生物能源有关。

3 瘤胃微生物的研究方法

传统的瘤胃生态系统中微生物群落多样性及结构分析主要通过分离培养、计数和分类鉴定，然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现型来分析。微生物的分离培养可以充实瘤胃微生物菌种资源，用于研究微生物生理功能与代谢，尤其参与日粮营养物质降解代谢[19]。目前常用的瘤胃微生物分离培养的方法主要包括以下几种：

3.1 亨氏滚管法

亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家Hungate于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。目前滚管法是培养厌氧微生物最常用的方法，并以其姓氏命名为亨氏管。亨盖特厌氧滚管培养技术可以用于微生物的分离和鉴定，也可以用于活菌培养计数。

3.2 厌氧培养箱

厌氧培养箱亦称厌氧工作站或厌氧手套箱，是机械和电子技术发展的产物。原理是通过真空泵先将箱内氧气抽出，充入氮气和混合气体使箱内形成厌氧环境，能够为厌氧微生物提供严格的厌氧环境和恒定的温度培养条件，进而可以进行取样制样、划线分离、接种、生化鉴定等标准的微生物实验操作。其优点是可以避免厌氧微生物在大气中操作时接触氧气而死亡；操作简便，可随时进行样品的放置、取出、观察；箱体容量大，可以大规模地生产。缺点是建设成本及维护成本都非常高[20]。

3.3 厌氧罐

厌氧罐是用聚碳酸酯制成的圆柱形透明罐体，配有硅橡胶密封圈，以保证密封。原理是采用抽气换气法彻底驱走罐内原有空气，操作步骤为：抽真空→灌N2→抽真空→灌混合气体（N2、CO2和H2），最后罐内少量剩余氧气将在钯的催化下，与混合气体中的H2合成H2O，从而形成良好的无氧环境。也可以用商品化的“GasPak”内源性产气袋替代上述繁琐的抽气换气方法。只需把这种产气袋的外表塑料层移去，立即放入厌氧罐并封闭，它就会通过袋内药品的化学反应消除氧气，产生CO2和H2。

此外，还有蜡烛耗氧法和厌氧袋法。前者是利用蜡烛燃烧消耗封闭容器里的氧气，产生二氧化碳，在封闭容器内形成厌氧环境。此法产生的厌氧环境很难得到保证，培养过程不方便操作。后者是利用袋内的药品将氧气吸收从而达到无氧状态，优点是能够保证厌氧环境；缺点是不能满足大量生产的需要，而且成本较高。

4 分子生物学在瘤胃微生物中的应用

分子生物学方法可以用来研究瘤胃微生物的多样性、群落结构、种群动态及日粮组分的降解和转化，既能够精确地反映微生物的分布情况，也可以直接对微生物数量进行准确定量。

目前常用的分子生物学方法有实时荧光定量PCR （RT-PCR）[21]、Sanger测序、16S rDNA克隆文库分析[22]，PCR-DGGE[23]、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）、基因芯片[24]、焦磷酸测序[25]、宏基因组测序[26]和高通量测序[27]等。虽然分子生物学技术的广泛应用在微生物多样性、挖掘基因资源、功能验证方面发挥了作用，充分弥补了纯培养技术的不足，但其不能得到单个的微生物菌体，不能充分了解微生物的生理生化特点和其在瘤胃发酵中的作用，所以将分子生物学方法和传统的培养方法结合起来，才能够深入地了解瘤胃微生物和开发应用这些微生物资源。

5 小结

综上所述，在反刍动物瘤胃中，真菌、细菌和原虫的比例和数量之间的任何变化，都可能导致不同种类反刍动物消化能力的差异，所以可以推测，水牛拥有一个独特的瘤胃系统，其多样性的微生物群落与其他品种牛是有差异的，也许正是这些差异解释了水牛的耐粗性等生物学特性。日粮可以调控水牛瘤胃微生物群落的组成和分布，通过了解水牛瘤胃微生物与日粮之间的关系，可为粗饲料在水牛日粮中的应用提供理论依据和数据支持。同样也可以从水牛瘤胃中分离出纤维素降解能力较高的菌株接种到其他反刍动物中，通过调控该菌来提高粗饲料消化率，充分利用瘤胃微生物资源，提高反刍动物生产性能。根据目前的数据，水牛瘤胃微生物的多样性还未充分了解，需利用现代分子生物技术进行进一步探索。

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10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.001

2016-10-18

“十二五”国家支撑计划“猪牛繁殖障碍控制及生殖激素制剂开发”(2011BAD19B03)。

梁停停（1990-），女，硕士生，研究方向为动物营养与饲料科学。

李翔（1971-），湖北监利人，男，副教授，研究方向为特种经济动物饲养。马立保（1965-），湖北随州人，男，副教授，研究方向为动物营养与饲料科学。