1,25二羟维生素D3诱导喉癌细胞Hep-2细胞凋亡及其对Bax/Bcl-2蛋白表达水平的影响

桂明才 李兵 戚思国 周长华

(1达州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 达州635000；2重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，重庆400016)

1,25二羟维生素D3诱导喉癌细胞Hep-2细胞凋亡及其对Bax/Bcl-2蛋白表达水平的影响

桂明才1李兵2△戚思国1周长华1

(1达州市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，四川 达州635000；2重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科，重庆400016)

目的 研究1,25二羟维生素D3抑制人喉癌Hep-2 细胞增殖作用，诱导细胞凋亡及其凋亡相关机制。方法 用不同剂量(10-8、10-7、10-6mol/L)1,25二羟维生素D3处理Hep-2细胞24 h、48 h、72 h，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测Hep-2细胞的增殖情况，计算抑制率。流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡率。Western blot检测用药前后细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。结果 1,25二羟维生素D3可以抑制Hep-2细胞增殖(P<0.05)，最高抑制率可达30.71%，在上述浓度内随着浓度增加、时间延长抑制作用逐渐增强，呈时间-剂量依赖性。10-7、10-6mol/L 1,25二羟维生素D3作用48 h后，Hep-2凋亡细胞比例显著增加，凋亡率高于空白对照组(P<0.05)。1,25二羟维生素D3处理48 h后，Hep-2细胞Bax蛋白表达上升，Bcl-2蛋白表达水平下降。结论 在一定浓度范围内1,25二羟维生素D3能够抑制人喉癌Hep-2细胞的增殖，呈时间-剂量依赖性，其抑制作用与诱导细胞凋亡有关；1,25二羟维生素D3可通过上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达诱导Hep-2细胞凋亡。

1,25二羟维生素D3； 喉癌； Hep-2细胞； 细胞凋亡

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是头颈部区域常见的恶性肿瘤之一，占人类所有恶性肿瘤的2%[1]。传统喉癌化疗药物对喉癌患者总的生存率一直没有明显提高，而且毒副作用明显，严重影响患者生活质量以及后续治疗，因此寻求高效、低毒的抗肿瘤药物已成为喉癌治疗方面的研究热点。1,25二羟维生素D3是一类人体所需的维生素，已有研究发现1,25二羟维生素D3可以诱导多种肿瘤细胞凋亡[2]。但目前尚无1,25二羟维生素D3作用于人喉癌Hep-2 细胞的国内外相关报道。

1 材料与方法

1.1 材料

人喉上皮样癌Hep-2 细胞株(南京凯基生物有限公司)；Bax、Bcl-2和β-actin 单克隆抗体(Santa Cruz公司)；辣根过氧化酶标记物山羊抗小鼠IgG(二抗)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；1,25二羟维生素D3(Sigma 公司)，溶于RPMI1640 培养基制成10 mmol/L 的母液，过滤除菌后-20 ℃备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和药物处理 人喉癌Hep-2 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1 640 培养液中，置入培养箱(37 ℃，体积分数为5%二氧化碳，饱和湿度)进行培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT 法测定细胞增殖抑制效应 收集对数生长期细胞，调整细胞浓度7.5×104个细胞/mL细胞悬液，按100 μL/孔接种。细胞贴壁后分组，加入1,25二羟维生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)继续培养24、48及72 h后终止。终止前4 h每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL 并继续培养4 h后弃上清液，每孔加入DMSO150 μL，振荡10 min，用酶联免疫检测仪测各孔吸光度值(A 值)计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(对照组A 值- 给药组A 值)/对照组A 值×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集对数生长期Hep-2细胞，制成细胞悬液，以1×106/mL细胞浓度10 mL接种于100 mL培养瓶中，培养24h。各实验分组分别加入不同浓度1,25二羟维生素D3，培养48 h，2 000 rpm离心5 min收集细胞达到5×105/mL细胞浓度。加500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，与2 μL Annexin V-FITC混匀后，加5 μL Propidium Iodide，混匀。室温、避光、反应10 min。于1h内用流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。进行结果分析并成像保存。

1.2.4 电镜观察INS-1细胞超微结构变化

收集对数生长期的Hep-2 细胞，以1×106/mL细胞浓度10 mL接种在100 mL培养瓶中，培养24 h。各实验分组分别加入不同浓度1,25二羟维生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)，培养48 h后转移入1 mL EP管，2 000 rpm离心20 min成团块状，吸尽上清后，缓慢加入4%戊二醛，于4 ℃冰箱保存，2 h后用 0.1 M的PBS(pH7.2)冲洗。1%饿酸固定1 h，丙酮酸梯度脱水，618环树脂，光镜定位，制备超薄切片。枸橼酸铀染色后，透射电镜观察、拍照并保存结果进行分析。

1.2.5 Western 蛋白印迹法检测1,25二羟维生素D3对Hep-2 细胞Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平的影响 1,25二羟维生素D3作用48 h后提取细胞总蛋白。凝胶电泳，转膜。封闭后与加稀释一抗抗体(靶蛋白抗体)4 ℃过夜。加入稀释的2抗室温孵育2 h，显色，曝光、显影和定影。吸光度扫描分析后计算各组细胞靶蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞的生长抑制作用随药物浓度的升高而增强，剂量效应关系显著。在一定浓度下(10-6、10-7、10-8mol/L)，随作用时间的延长1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞增殖抑制作用也增强，提示1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞的抑制效应呈剂量和时间依赖性。见表1。

表1 1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞生长抑制作用

注：干预组1：1,25二羟维生素D3浓度为10-8mmol/L；干预组2：1,25二羟维生素D3浓度为10-7mmol/L；干预组3：1,25二羟维生素D3浓度为10-6mmol/L。不同浓度、不同作用时间与相应对照组吸光度值及抑制率比较，*P<0.01；相同作用时间、不同浓度之间吸光度值比较，△P<0.01；不同作用时间、相同浓度之间吸光度值比较，■P<0.01。

2.2 1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞凋亡的影响

不同浓度1,25二羟维生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)作用Hep-2细胞48 h后，细胞早期凋亡的检测结果见图1，凋亡率见图2，不同浓度1,25二羟维生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)干预组凋亡率显著高于对照组自发凋亡率的1.82%(P<0.01)。表明1,25二羟维生素D3对Hep-2 细胞具有诱导凋亡作用，且呈浓度依赖性。

注：A：对照组；B：1,25二羟维生素D3浓度为10-8 mmol/L；C：1,25二羟维生素D3浓度为10-7 mmol/L；D：1,25二羟维生素D3浓度为10-6 mmol/L。图1 Annexin Ⅴ标记法检测1,25二羟维生素D3诱导Hep-2细胞凋亡

注：A：对照组；B：1,25二羟维生素D3浓度为10-8 mmol/L；C：1,25二羟维生素D3浓度为10-7 mmol/L；D：1,25二羟维生素D3浓度为10-6 mmol/L。与对照组比较，**P<0.01。图2 Annexin Ⅴ标记法检测1,25二羟维生素D3诱导Hep-2细胞凋亡率

2.3 电镜观察1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞凋亡的影响

电镜下可见，对照组Hep-2细胞在48 h后体积较大，细胞结构规则，表面可见伪足和微绒毛，核幼稚、核仁清楚(2～5个)、常染色质丰富，异染色质少，核浆比例大，胞浆内有一定数量线粒体，糖原含量低，基质电子密度较高。不同浓度1,25二羟维生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)干预组Hep-2细胞在48 h后与对照组比较，细胞整体结构紊乱，部分细胞结构不清楚、边缘不整齐，细胞体积缩小(胞核缩小)导致核浆比例小, 核仁减少或消失，异染色质增多，胞核内出现大量空泡，表面微绒毛和伪足减少，可见较多碎片的凋亡小体(图3)。

注：A：对照组；B：1,25二羟维生素D3浓度为10-8 mmol/L；C：1,25二羟维生素D3浓度为10-7 mmol/L；D：1,25二羟维生素D3浓度为10-6 mmol/L。图3 1,25二羟维生素D3诱导Hep-2细胞凋亡48 h后电镜下形态(TEM×5000)

2.4 1,25二羟维生素D3对Hep-2 细胞Bax 和Bcl-2蛋白表达水平的影响

经1,25二羟维生素D3作用48 h后，Hep-2 细胞Bcl-2 蛋白表达明显降低，不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)，随浓度增加，蛋白表达降低越明显；Bax蛋白表达明显增高，不同浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)，随浓度增加，蛋白表达增高越明显。见图4。

注：A：对照组；B：1,25二羟维生素D3浓度为10-8 mmol/L；C：1,25二羟维生素D3浓度为10-7 mmol/L；D：1,25二羟维生素D3浓度为10-6 mmol/L。与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01)。图4 不同浓度1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞Bax 和Bcl-2蛋白表达水平的影响

3 讨 论

1,25二羟维生素D3能维持体内钙环境的相对稳定，参与调节免疫功能，目前被认为不仅仅是人体所需的一类维生素，而且能够影响肿瘤的生物学活性，可能干预肿瘤细胞的增殖和凋亡[3]。1,25二羟维生素D3的作用是通过结合并激活细胞内特异性维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)而实现的[4]。已有研究证实，1,25二羟维生素D3具有抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤侵袭性以及抑制血管新生等作用[5]。本研究通过MTT法检测细胞存活率，结果显示：经不同浓度1,25二羟维生素D3处理Hep-2细胞24 h、48 h和72 h后，1,25二羟维生素D3对喉癌Hep-2细胞增殖具有抑制作用，且呈浓度和剂量依赖性。

细胞凋亡是维持细胞生长平衡的重要途径，与肿瘤的生长及发展密切相关 。其形态学改变可以通过电子显微镜直接观察。本实验电镜下可见，不同浓度实验组中均可看到凋亡细胞特征，细胞整体结构紊乱，核仁明显减少、染色深、染色体浓缩、边集，核裂碎呈大小不等、形态不规则的碎片状，并有凋亡小体形成。本实验中采用 Annexin Ⅴ-FITC双标记法检测Hep-2细胞早期凋亡，证实了不同浓度1,25二羟维生素D3可诱导Hep-2细胞凋亡。10-8、10-7、10-6mol/L 1,25二羟维生素D3在48h对Hep-2细胞凋亡率分别为12.04%、17.10%、25.13%，明显高于对照组的1.82%(P<0.01)。随着1,25二羟维生素D3浓度增加，Hep-2细胞的凋亡率也明显增加。

大量研究已经证实Bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)对细胞凋亡有抑制作用，近年来的一些研究已开始揭示这一作用的机制[6]。Bcl-2 家族蛋白通过二聚体网络的形式相互作用，调控细胞凋亡，不同二聚体间的精细平衡决定了细胞是继续存活还是走向死亡[8]。本研究发现1,25二羟维生素D3干预组在48h时Bcl-2蛋白表达均较对照组降低，浓度越高，降低越明显。而1,25二羟维生素D3干预组在48h时Bax蛋白表达均较对照组升高，随浓度增加升高越明显。可见1,25二羟维生素D3可下调Bcl-2蛋白表达，使Bcl-2抑制凋亡作用减弱，并增强Bax的凋亡作用，从而促进细胞凋亡。

综上所述，不同浓度1,25二羟维生素D3可促进Hep-2细胞凋亡，随着浓度增加和作用时间延长，细胞凋亡现象越突出，细胞增殖抑制也越明显，在一定浓度范围内1,25二羟维生素D3对Hep-2细胞增殖抑制作用呈量-效和时-效关系。本实验结果提示，1,25二羟维生素D3可诱导Hep-2细胞凋亡，深入研究其凋亡作用途径及其机制，可以为喉癌的临床治疗提供理论证据。本实验不足之处在于需要细化和增加1,25二羟维生素D3作用浓度，以利于更好地研究不同浓度1,25二羟维生素D3诱导Hep-2细胞的凋亡作用；也需要进一步进行动物实验，观察不同浓度1,25二羟维生素D3在体内对喉癌细胞的影响，并检测临床患者喉癌标本和血清中的1,25二羟维生素D3相应代谢物浓度，进一步为临床治疗提供实验依据。

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[8] Vitagliano O,Addeo R,D'Angelo V,et al. The Bcl-2/Bax and Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways: implications in pediatric leukemia pathogenesis and new prospects for therapeutic approaches[J]. Expert Rev Hematol，2013，6(5):587-597.

Mechanisms of human laryngeal carcinoma Hep-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction by 1,25-dihydroxyvitamin D3

GuiMingcai1,LiBing2,QiSiguo1,ZhouChanghua1.

1.DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,DazhouCentralHospital,Dazhou635000,Sichuan,China. 2.DepartmentsofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.

Objective To investigate the mechanisms of human laryngeal carcinoma Hep-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction by 1, 25-dihydroxyvitamin D3. Methods Hep-2 cells were processed by different concentration of 1, 25 dihydroxyvitamin D3 (10-8and 10-7and 10-6 mol / L) for 24 hrs, 48 hrs and 72 hrs. The Hep-2 cells proliferation and inhibition rate were detected and calculated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). Apoptosis rate of Hep-2 cells was detected by flow cytometry. The expression levels of Bax and Bcl-2 were analyzed by western blot (WB).Results MTT results were shown that 1, 25-dihydroxyvitamin D3 can inhibit the proliferation of Hep-2 cells (P<0.05). The highest inhibition rate reached 30.71%, in a time-and dose-dependent manner. Flow cytometry showed 1, 25 dihydroxyvitamin D3 with 10-7, 10-6mol/L significantly increased Hep-2 cell apoptosis rate after 48 hrs (P<0.05). West blot (WB) results were shown that Bax protein expression increased and Bcl-2 protein expression decreased after 1, 25-dihydroxyvitamin D3 treatment for 48 hrs.Conclusion A certain range of concentration of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 (10-6to 10-7and 10-8mol/L) can inhibit proliferation of human laryngeal carcinoma Hep-2 Cells, in a time and dose dependent manner, probably through induced apoptosis. 1, 25-dihydroxyvitamin D3 can up-regulate Bax protein expression and down-regulate Bcl-2 protein expression to induce the apoptosis of Hep-2 cells.

1,25-dihydroxyvitamin D3; Laryngeal carcinoma; Hep-2 cells; Apoptosis

重庆市自然科学基金资助项目( No:cstc2013jcyjA10059)

R739.65

A

1000-744X(2016)08-0790-04

2016-03-23)

△通信作者，E-mail:634339717@qq.com