荧光原位杂交技术及染色体核型分析在产前诊断中的应用

郑慧玲 郑琳 朱晓西 杨雪 吴忠琴

(贵阳市妇幼保健院优生遗传科，贵州 贵阳 550003)

·技术与方法·

荧光原位杂交技术及染色体核型分析在产前诊断中的应用

郑慧玲 郑琳 朱晓西 杨雪 吴忠琴

(贵阳市妇幼保健院优生遗传科，贵州 贵阳 550003)

目的 探讨荧光原位杂交技术(FISH)及染色体核型分析技术在产前诊断中的应用价值。方法 应用FISH技术对未培养的羊水间期细胞进行13、16、18、21、X/Y号染色体数目检测，同时对培养后的羊水中期细胞进行染色体核型分析。结果 600例羊水标本FISH检测均得出结果，检测成功率为100%，FISH检测出31例阳性结果，异常核型检出率为5.2%。600例羊水标本染色体核型分析中598例检测出结果，2例标本污染无法分析，检测成功率为99.7%。598例检测结果中阳性结果63例，异常核型检出率为10.5%。结论 FISH检测羊水胎儿染色体非整倍体的方法过程简便、快速，成功率高，结论可靠。但只能检出特定染色体的非整倍体，应用有一定的局限性。与传统染色体核型分析技术相互联合、补充，可以更好地应用于产前诊断中。

荧光原位杂交； 核型分析； 染色体异常； 产前诊断

在目前的医疗条件下，染色体病尚无有效的治疗方法，染色体异常在新生儿的发病率为0.1%～0.2%，最常见的是21-三体综合征，其次为Turner综合征、18-三体综合征、13-三体综合征及Klinefelter综合征等。产前诊断是防止具有严重遗传病、智力障碍及先天畸形患儿出生的有效措施。目前对胎儿染色体疾病的产前诊断多采用孕中期行羊膜腔穿刺羊水细胞培养，对染色体中期分裂相进行核型分析，操作时间长且技术复杂。现荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)作为一种成熟技术在国内外临床中得到广泛地应用，它利用已知碱基序列作为探针，以非放射性荧光物质标记后对待测核酸进行定性、定位及相对定量分析[1]，这项技术的应用大大地提高了诊断效率，缩短了诊断时间。我们同时采用羊水间期细胞的FISH检测及中期细胞染色体核型分析对我院600例羊水标本进行检测，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2012年2月至2014年5月在我院优生遗传门诊需进行产前诊断的孕妇600例，年龄19～44岁，孕周16～25周。产前诊断指征包括高龄孕妇185例、血清学筛查高危255例、B超异常9例、不良孕产史42例、多项指征(符合前面两项及两项以上)76例以及其他33例。所有孕妇均签署行FISH检测及核型分析知情同意书。在B超引导下经腹抽取羊水20～30 mL，置于三个无菌试管中待检。一管用于FISH检测，两管用于细胞培养进行核型分析。

1.2 主要试剂 选用英国Cytocell公司的CEP18/X/Y及LSI13/21探针。

1.3 实验方法 (1)羊水间期细胞的处理：一管羊水标本离心→低渗30 min→固定→滴片→56 ℃老化2 h→0.05 g/L胃蛋白酶消化17 min→PBS漂洗→后固定→PBS漂洗→70%、90%、100%冰乙醇梯度脱水各3 min，晾干。(2)杂交：加探针至相应玻片上，封片，变性3 min后37℃杂交2 h→洗脱→暗处风干→复染。(3)阅片：荧光显微镜下观察，每例计数50～100个细胞，镜下观察若>60%的核显示非整倍体信号则该样本判断为非整倍体；若5%～60%的核显示非整倍体信号则提示该样本有可能为嵌合体，在中期细胞核型分析时应加大计数。(4)染色体核型分析：两管羊水离心去上清，取沉淀物0.5 mL加入4.5 mL羊水细胞培养基混匀加入培养瓶中，至37℃、5%CO2培养箱内培养，一周后每天观察，收获并制片，G显带后进行核型分析，计数30个中期细胞，并分析4个核型。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计分析。不同产前诊断指征检测数据采用卡方检验统计处理。

2 结 果

2.1 间期羊水细胞FISH检测结果 600例标本FISH检测全部成功，检测成功率为100%，报告时间为1～3 d。结果显示：31例阳性结果，包括19例21-三体、6例18-三体、2例45,XO、1例47,XXY、1例48,XXX,+18及2例嵌合体,阳性结果检出率为5.2%,569例阴性结果。见表1。

2.2 培养中期细胞染色体核型分析结果 600例标本中，598例培养成功，成功率为99.7%，报告时间为10～20 d;2例未培养成功标本FISH检测正常，孕妇拒绝再次检测，胎儿分娩后随访新生儿健康。培养成功标本全部进行了染色体核型分析，结果显示：63例阳性结果，阳性检出率为10.5%。其中数目异常30例，孕妇知情选择引产；结构异常15例，2例孕妇知情选择引产；多态变异18例。结构异常和多态异变的33例中，31例均遗传自父源或母源，孕妇选择继续妊娠。其余535例未发现染色体明显异常。见表1。

表1 FISH检测阳性结果与染色体核型分析阳性结果对比

2.3 FISH检测出的染色体异常与产前诊断指征的相关性 600例标本中，42.5%的孕妇因血清学筛查高危而行产前诊断，FISH检测出5.88%的阳性结果；30.8%的孕妇因高龄行产前诊断，共检出2.2%的阳性结果；1.5%的孕妇因B超异常而行产前诊断，检出22.2%的阳性结果；12.7%的孕妇因多项指征而行产前诊断，检出13.2%的阳性结果；而12.7%的孕妇因不良孕产史或其他原因而行产前诊断，未检出阳性结果。见表2。

表2 不同产前诊断指征检测结果比较

注：与B超异常相比，aP<0.01；与多项指征相比，bP<0.01。

3 讨 论

产前诊断是降低新生儿出生缺陷的有效途径之一。传统的染色体核型分析技术作为产前诊断的金标准一直备受重视，但由于其操作技术要求高，报告时间长，对染色体嵌合现象难于解释等弊端，已成为产前诊断发展的瓶颈。自从1986年Gremer等[2]将FISH技术应用于间期细胞核检测染色体非整倍体异常，其以成功率高、简便、快速检测的优势架起了细胞遗传学与分子遗传学的桥梁，开辟了间期细胞遗传学研究，为快速产前诊断提供了有效的应用平台。

新生儿最常见的染色体异常是21、13、18号染色体的三体和X染色体单体及其他性染色体的非整倍体[3]，据统计，这些异常在临床上占染色体异常的80%以上。本资料中，33例结构异常和多态变异标本中，31例均来自父源或母源，B超随检未发现异常继续妊娠 ，生产后新生儿随访健康，其余2例中1例21-三体、1例18号染色体部分缺失引产。以发病风险计算，FISH检测阴性结果的发病风险为0.35%，也就是说，FISH检测阴性，99.6%的胎儿都是正常的，这与其他学者[4-5]的研究结果相符。

目前，B超引导进行羊膜腔穿刺获得羊水是我国产前诊断的主要方法之一，本资料600例病例均进行产后跟踪随访，除32例染色体异常选择引产及1例穿刺45 d后流产外，其余孕妇无因穿刺操作引起的感染、流产、胎儿损伤等并发症，随访新生儿健康。虽然现已有非创伤性方法以获得胎儿DNA，但羊水细胞核型分析仍然是产前诊断的金标准。

本实验对600例标本同时进行了FISH检测和染色体核型分析，单就13、18、21、性染色体非整倍体的检测来说，核型分析检测到的30例阳性标本在FISH检测中均能检测到；另外，结构异常标本中有1例核型为[46,XX,der(14;21)(q10;q10),+21]，FISH也检测到21号染色体有三个信号，这足以证明FISH的敏感性、特异性与核型分析结果一致，与国内外其他学者的研究相符[6]。2例嵌合体标本FISH也有检测到，其中核型为47,XX,+21[7]/46,XX[93]的标本FISH检测提示21号染色体信号为2个的占92%，信号为3个的占8%。国外有学者认为未培养羊水细胞比培养细胞有可能更好地反映染色体嵌合现象[7]。然而由于FISH检测有可能会出现非特异性信号，对于提示有嵌合体存在的标本我们要结合核型分析结果进行诊断结果的咨询。FISH检测由于自身的局限性使得其不能像核型分析一样检测到染色体的结构异常，也不能检测到除13、18、21、性染色体以外的其他19对染色体的数目异常，因此本资料中有14例染色体结构异常和18例染色体多态FISH无法检测出来。这提示我们，FISH作为快速产前诊断非整倍体的检测平台，有较大的临床应用价值，但不能完全代替传统的核型分析方法，将两者取长补短、相互补充，在提高检测成功率的同时提高检测效率才能为临床遗传咨询提供完整准确的实验室依据。

[1] 孙筱放,黎青,黄艳秋,等.荧光原位杂交技术在细胞遗传学中的应用[J].现代妇产科进展,1996，5(4)：318.

[2] Gremer T , Lundegen J.Detection of chromosom eaberration in the human in terfuse nucleus by visualizat ion of special target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridizationt echniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L184[J]. Hum Genet,1986,74:346-352.

[3] Schubert R,Raff R, Schwanitz G. Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism[J]. Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.

[4] Eiben B, Trawicki W, Hammans W, et al. A prospective comparative study on fluorescence in situ hybridization (FISH) of uncultured amniocytes and standard karyotype analysis[J].Prenat Diagn,1998,18(9):901-906.

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