施氮量对烤烟烟叶抗氧化系统及质量的影响

李利建， 王 涛， 毛 岚， 李 凌， 赵应虎， 赵友谊， 任 情， 刘建军， 张宏景

(云南省烟草公司 曲靖市公司，云南曲靖 655000)



施氮量对烤烟烟叶抗氧化系统及质量的影响

李利建， 王 涛， 毛 岚， 李 凌， 赵应虎， 赵友谊， 任 情， 刘建军， 张宏景

(云南省烟草公司 曲靖市公司，云南曲靖 655000)

[目的]研究施氮量对烤烟烟叶抗氧化系统及质量的影响。[方法]以K326为试验材料，对不同施氮水平烤烟生长成熟期间烟叶活性氧含量、SOD活性、GR活性、APX活性、抗氧化剂含量、化学成分进行了研究。[结果]随着烟叶在田间的生长成熟，烟叶内超氧阴离子产生速率、过氧化氢的含量呈增加趋势；抗氧化酶活性整体呈先上升后下降的趋势；抗氧化剂GSH逐渐下降；AsA含量在生长前期逐渐增加，但生长后期逐渐下降。不同施氮水平对烤烟烟叶生长成熟期间抗氧化系统有显著影响。在高氮水平下，烟叶内活性氧清除系统中的自由基清除剂(GSH、AsA)和相关酶活性(SOD、GR、APX)均显著或极显著高于低氮水平处理。随着施氮量的增加，烤后烟叶含氮化合物显著增高，蛋白质、淀粉、叶绿素和类胡萝卜素等大分子物质降解量减少，石油醚提取物显著减少，但对钾和氯影响不显著，烟叶质量降低。[结论]烤烟大田管理中适量施氮(45.0 kg/hm2)有利于烟叶生长前期保持较高抗氧化活性，抵御胁迫，在成熟期确保适时成熟，提高烟叶质量。

烤烟；氮；抗氧化系统；化学成分

叶片的光合作用是植物全株光合产物主要源，光合作用时间的长短主要取决于叶片衰老的进程[1]。因此，烤烟烟叶的产量和质量与其衰老密切相关。目前研究普遍认为作物的衰老过程是细胞和组织中不断进行着自由基损伤反应的总和。烟株打顶后，进入成熟期，烟叶内超氧自由基和过氧化氢迅速增加，抗氧化系统及其相关酶活性持续下降，氧化胁迫造成衰老加剧[2-5]。但通过外源添加抗氧化剂能明显延缓烟叶的衰老[6]。氮素是烟草生长发育的必需营养元素，在保护酶代谢中起着重要作用。氮素缺乏会引起作物叶片叶绿素、蛋白质含量下降，丙二醛含量升高，加速叶片衰老进程[7]。在烟草氮肥施用中，氮肥不足导致烟叶提前衰老，烟叶质量差；氮肥过多则成熟期推迟，病害加重，内在化学成分协调性较差。氮肥水平和形态对烟叶生长及质量具有显著影响[8]。但目前有关施氮量对烟叶生长成熟过程抗氧化系统及其质量影响的研究鲜有报道。基于此，该试验研究了不同供氮水平对烟叶活性氧、抗氧化系统和烟叶质量的影响，以期为特色优质烟叶生产中合理施肥提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验于2014年在云南省师宗县大同街道长桥村进行。供试烤烟品种K326，4月15日膜下小苗移栽，行距120 cm，株距50 cm，按照优质烤烟生产技术规范栽培管理。

1.2 试验设计 试验设3个施氮水平处理，低氮(T1)施用纯氮22.5 kg/hm2，中氮(T2)施用纯氮45.0 kg/hm2，高氮(T3)施用纯氮67.5 kg/hm2；小区面积100 m2，3次重复，随机排列，试验区周围设置保护行。不同处理间磷、钾肥施用量相同，都为P2O590.0 kg/hm2、K2O 157.5 kg/hm2，施用方法和时间一致。试验所用氮、磷、钾肥分别为尿素(N 46%)、过磷酸钙(P2O516%)和硫酸钾(K2O 51%)；磷肥全部基施，氮肥和钾肥的追肥在移栽后25～30 d浇施，基肥与追肥比例为17∶3。以幼叶长出0.5 cm时开始计算叶龄，自叶龄25 d起每隔15 d取各处理生长基本一致的第10位叶对抗氧化系统各项指标进行测定；各处理分别取中橘三(C3F)等级的烤后烟叶1 kg进行主要化学成分的测定。

1.3 测定项目与方法 过氧化氢和抗坏血酸含量参照李合生等[9]的方法测定，谷胱甘肽含量参照Arnon[10]的方法测定；谷胱甘肽还原酶活性测定参照Foyer等[11]的方法，抗坏血酸过氧化物酶活性测定参照Nakano等[12]的方法。烤后烟叶总氮、蛋白质、烟碱、淀粉、总糖、还原糖、钾、氯和石油醚提取物含量测定参照王瑞新等[13]的方法，叶绿素和类胡萝卜素含量测定采用分光光度法[14]。

1.4 数据处理 采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0进行绘图和数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 施氮量对烟叶活性氧含量的影响 植物体内活性氧是有氧转化而成的氧代谢产物及其衍生的含氧物质，主要包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等[15]。由图1a可知，烤烟田间生长成熟过程中烟叶内超氧阴离子的产生速率呈上升趋势。在55 d以前，各处理之间差异不显著；55 d以后，各处理间差异增大，且超氧阴离子产生速率显著增加，其中T1处理的超氧阴离子产生速率最高，而T3处理最低。由图1b可知，过氧化氢含量也呈逐渐上升趋势，在叶龄55 d时随着烟叶的逐渐成熟过氧化氢含量增幅加快，并在叶龄85 d时达到最高；不同施氮水平下，各阶段T3处理的过氧化氢含量较高，其次为T2处理，T1处理最低；且T3处理烟叶过氧化氢含量与T1处理之间差异极显著。

注:同时间不同大、小写字母分别表示处理间差异达到0.01和0.05显著水平。Note:Different capital letters and lowercases at the same leaf age indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively. 图1 施氮量对烟叶活性氧含量的影响Fig. 1 Effects of nitrogen application level on active oxygen content of tobacco leaves

2.2 施氮量对烟叶抗氧化酶活性的影响

2.2.1 施氮量对烟叶SOD活性的影响。由图2可知，不同施氮量对烟叶生长成熟过程中SOD活性的影响显著，在叶龄55 d内，各处理SOD活性均呈缓慢增加的趋势；55 d后T1处理的SOD活性逐步下降，T2处理继续增加并在70 d后开始下降，而T3处理则一直呈增加趋势。

图2 施氮量对烟叶SOD活性的影响Fig. 2 Effects of nitrogen application level on SOD activity of tobacco leaves

2.2.2 施氮量对烟叶谷胱甘肽-抗坏血酸循环系统酶活性的影响。植物在逆境胁迫下，通过提高GR和APX的活性能增强活性氧的清除作用，降低氧化胁迫[16-17]。由图3a可知，烤烟生长成熟过程中，烟叶GR活性先升高并保持较高酶活性，然后在叶龄70 d后呈下降趋势。不同施氮水平的3个处理中，在25 d时T2处理GR活性最高，而T1处理最低；随着烟叶生长成熟，T3处理的酶活性一直保持较高水平，其次为T2处理，T1处理酶活性较低；在85 d时，T2和T3处理的GR活性差异不显著，但均与T1处理之间差异极显著。由图3b可知，APX活性在生长成熟过程中25～55 d时呈上升趋势，55 d后逐渐下降；3个施氮水平处理中，整个生长成熟期均以T3处理的酶活性较高，T1处理较低；其中，在25～40 d时T2和T3处理烟叶酶活性差异不显著，但均与T1之间差异极显著；55～70 d时T3处理烟叶酶活性下降幅度明显小于T1和T2处理，但70 d后酶活性下降幅度明显增大。

2.3 施氮量对烟叶抗氧化剂含量的影响 GSH是植物抗氧化系统中重要的非酶类物质，其含量和GSH/GSSG比值是激活植物抗性基因的信号之一[18]。烤烟生长成熟过程中GSH含量呈逐渐下降趋势，并在55 d后下降趋势有所加快(图4a)。其中，在25 d时3个不同施氮水平处理的烟叶内GSH含量差异显著；随着烟叶的成熟衰老，烟叶内GSH含量差异显著减小；在40～55 d时T1和T2处理差异不显著，但均与T3处理差异显著；70 d时，3个处理的差异均不显著；而在85 d时，T2处理与T3和T1处理差异均不显著，但T1处理与T3处理间差异显著。

AsA是植物体内普遍存在的一种高丰度小分子的非酶类自由基清除剂，能够直接清除O2-·和H2O2等，对植物抵抗胁迫有重要作用[19]。由图4b可知，烤烟在生长成熟过程中AsA含量呈先上升后缓慢下降的趋势，在叶龄40 d 时最大，而在70 d时下降幅度略有增加。3个不同施氮水平处理中，T3处理的烟叶内AsA含量一直高于其他2个处理，在40 d时3个处理差异极显著；在25和55～85 d时T2和T3处理间差异显著，而T2处理和T3与T1处理差异均达到极显著水平。

图3 施氮量对烟叶GR和APX活性的影响Fig. 3 Effects of nitrogen application level on the GR and APX activities of tobacco leaves

注:同时间不同大写和小写字母分别表示处理间差异达到0.01和0.05显著水平。Note:Different capital letters and lowercases at the same leaf age indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively. 图4 施氮量对烟叶GSH和AsA含量的影响Fig. 4 Effects of nitrogen application level on the GSH and AsA contents of tobacco leaves

2.4 施氮量对烤后烟叶主要化学成分的影响 由表1可知，不同施氮水平对烤后烟叶内在品质有重要影响。烤后烟叶含氮化合物随着施氮量的增加而增加，即T3处理的含氮化合物最高；3个处理烟叶总氮含量为1.88%～3.25%，均处于适宜范围，但T2处理较接近最适值，且T3处理总氮含量与T1和T2处理间均达到差异极显著，T1和T2处理间差异显著；蛋白质含量中，T3处理含量明显高于优质烟叶要求范围7%～10%，T1和T2处理差异不显著且含量适宜；3个处理的烟碱含量均比较适宜，其中T2和T3处理间差异不显著，但这2个处理均与T1处理间差异显著。淀粉含量以T1处理最低，T3处理最高，其中T1与T2和T3处理间差异极显著，T2和T3处理间差异显著。T2处理的总糖含量和还原糖含量较高，但3个处理之间差异显著；适宜施氮量有利于烟叶淀粉降解和糖类物质的积累。色素类物质中，3个处理之间略有差异，其中T3处理的叶绿素a含量最高，与其他2个处理间差异显著；叶绿素b含量在3个处理之间差异不显著；T3处理类胡萝卜素含量最高，与T1处理间差异显著，但与T2差异不显著。不同施氮量对烤后烟叶钾和氯含量无显著影响，3个处理的钾和氯差异不显著。T2处理的石油醚提取物最高，与T1处理间差异显著，与T3处理间差异极显著。综上可知，中氮水平(45.0 kg/hm2)的施氮量有利于烤后烟叶品质的提高。

3 结论与讨论

随着植物的生长成熟，在衰老过程中，植物体内活性氧的产生与清除的动态平衡遭到破坏，生物氧自由基会大量积累[20-21]。烤烟在田间生长成熟过程中，进入成熟期随着成熟度的增加烟叶由氮代谢转向碳代谢，叶片结构逐渐疏松，细胞结构被破坏，细胞膜透性增加[22-23]。试验结果表明，随着烟叶在田间的生长成熟，烟叶内超氧阴离子的产生速率、过氧化氢的含量一直呈增加的趋势；抗氧化酶活性整体呈现先上升后下降的趋势；抗氧化剂GSH逐渐下降；AsA的含量在生长前期逐渐增加，但在生长后期逐渐下降，这与张波等[24]研究结果基本一致。李明军等[25]研究认为植物叶片在衰老开始时，能够通过GSH和AsA含量的上升来增加抵御能力，但随着衰老的加剧，AOS大量积累降低了相关酶活性，GSH和AsA含量开始下降。这与文锦芬等[26]的研究结果略有差异，可能是由于试验处理和生态环境不同所导致的。

植物叶片中的抗氧化系统存在明显的品种差异，且活性高低也受到生态环境的影响。该试验条件下，不同施氮水平对烤烟烟叶生长成熟期抗氧化系统具有显著的影响，低氮水平下烟叶内活性氧的含量虽然较低，但活性氧清除系统中的自由基清除剂和相关酶活性也普遍偏低；而在高氮水平下，烟叶内活性氧清除系统中的自由基清除剂和相关酶活性均显著或极显著高于低氮水平处理，烟叶抗氧化性提高，延缓叶片衰老。这主要是由于增施氮肥有利于提高叶片光能的吸收和转化效率，改善活性氧清除酶的代谢合成[27]。马松等[28]研究也表明，通过施用控释复合肥延缓肥料释放能显著降低超氧离子的产生，提高活性氧清除系统活性，延迟衰老。但烤烟以收获烟叶为主，要求产量与质量并重。随着施氮量的增加，烟叶活性氧清除系统活性较高，衰老延迟，但易造成氮代谢推迟，对光合效率产生反馈抑制，烟叶贪青晚熟，从而造成烟叶烘烤特性较差；较低的施氮量，烟叶提前衰老成熟，干物质积累较少，对烟叶质量不利[29-30]。而该试验结果也表明，随着施氮量的增加，烤后烟叶含氮化合物显著增高，蛋白质、淀粉、叶绿素和类胡萝卜素等大分子物质降解量减少，石油醚提取物显著减少，但对钾和氯影响不显著，烟叶质量降低。李春俭等[31]、王新发等[32]也认为施氮量过高造成色素等大分子物质残留量较高，烟叶品质下降。因此，在烤烟大田管理中，适量施氮有利于烟叶生长前期保持较高抗氧化活性，抵御环境胁迫；在成熟期确保适时成熟，提高烟叶质量。

表1 施氮量对烤后烟叶化学成分的影响

注:同列不同大写和小写字母分别表示差异达到0.01和0.05显著水平。

Note:Different capital letters and lowercases in the same column indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively.

[1] 匡艺,李廷轩,余海英.氮素对不同氮效率小黑麦基因型叶片保护酶活性和膜脂过氧化的影响[J].草业学报,2011,20(6):93-100.

[2] 张新华,姚忠达,陈常伟,等.打顶及仿生信号分子对烟草氧化胁迫的影响[J].烟草科技,2011(12):61-64,68.

[3] 宋朝鹏,王梦抒,梁瑞海,等.氮素形态对烤烟成熟过程中抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响[J].河南农业科学,2007(8):40-42.

[4] 江力,曹树青,张荣铣.过氧化氢对烟草光合功能衰退的影响[J].浙江大学学报(理学版),2006,33(5):578-583.

[5] 江力,孔小卫,曹树青,等.过氧化氢参与烟草叶片衰老调节的研究(简报)[J].分子细胞生物学报,2009,42(1):82-86.

[6] 梁太波,张景玲,田雷,等.干旱胁迫下外源甜菜碱和脯氨酸对烤烟抗氧化代谢的影响[J].烟草科技,2013(2):68-71.

[7] 刘连涛,李存东,孙红春,等.氮素营养水平对棉花不同部位叶片衰老的生理效应[J].植物营养与肥料学报,2007,13(5):910-914.

[8] 陈义强,刘国顺,习红昂.基于烟叶品质指数的氮、磷、钾施肥模型[J].植物营养与肥料学报,2013,19(3):632-643.

[9] 李合生，孙群，赵世杰，等.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社,2000.

[10] ARNON D I.Copper enzymes in isolated chloroplasts：Polyphenol oxidase inBetaVulgaris[J].Plant Physiol,1949,24(1):1-15.

[11] FOYER G H,HALLIWELL B.The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts:A proposed role in ascorbic acid metabolism [J].Planta,1976,133(1):21-25.

[12] NAKANO Y，ASADA K.Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts [J].Plant Cell Physiol,1981,22(5):867-880.

[13] 王瑞新,韩富根,杨素琴,等.烟草化学品质分析法[M].郑州:河南科学技术出版社,1990.

[14] 邹琦.植物生理生化实验指导[M].北京:中国农业出版社,1995:31-39.

[15] 莫亿伟,郑吉祥,李伟才,等.外源抗坏血酸和谷胱甘肽对荔枝保鲜效果的影响[J].农业工程学报,2010,26(3):363-368.

[16] Asada K.The water-water cycle as alternative photon and electron sinks [J].Phil Trans R Soc Lond B,2000,355:1419-1431.

[17] 汪洪,赵士诚,夏文建,等.不同浓度镉胁迫对玉米幼苗光合作用、膜质过氧化和抗氧化酶活性的影响[J].植物营养与肥料学报,2008,14(1):36-42.

[18] 朱云集,田文仲,谢迎新,等.硫素对冬小麦旗叶抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统的影响[J].西北植物学报,2010,30(11):2191-2196.

[19] 魏国平,朱月林,刘正鲁,等.硝酸钙胁迫对营养液栽培嫁接茄子叶片抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响[J].植物生态学报,2008,32(5):1023-1030.

[20] 李敏,张洪程,杨雄,等.高产氮高效型粳稻品种的叶片光合及衰老特性研究[J].中国水稻科学,2013,27(2):168-176.

[21] DHINDSA R S,PLUMB-DHINDA P,THORPE T A.Leaf senescence:Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation,and decreased levels of superoxide dismutase and catalase [J].J Exp Bot,1981,32(1):93-101.

[22] 宫长荣.烟草调制学[M].2版.北京:中国农业出版社,2011:102-126.

[23] 黄勇,周冀衡,杨虹琦,等.烤烟成熟过程中叶片和叶绿体的细胞学观察[J].作物学报,2006,32(11):1767-1770.

[24] 张波,肖曼,李红玉.高光照引起烟草叶片衰老过程中过氧化氢的代谢与相关酶活性变化规律[J].安徽农业大学学报,2007,34(4):477-480.

[25] 李明军,马锋旺,马春花,等.苹果叶片离体衰老过程中抗坏血酸代谢的变化[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2006,34(12):65-68,73.

[26] 文锦芬,柯学,徐超华,等.光质对烟草叶片生长发育过程中抗氧化系统的影响[J].西北植物学报,2011,31(9):1799-1804.

[27] 周静,孟桂元,龙继锐,等.缓释氮肥用量对超级杂交早稻株两优02产量和生理特性的影响[J].杂交水稻,2011,26(6):62-68.

[28] 马松,许自成,苏永士,等.施用控释复合肥对烤烟叶片抗氧化系统的影响[J].中国生态农业学报,2011,19(2):276-279.

[29] 云菲,刘国顺,史宏志.光氮互作对烟草气体交换和部分碳氮代谢酶活性及品质的影响[J].作物学报,2010,36(3):508-516.

[30] 秦艳青,李春俭,赵正雄,等.不同供氮方式和供氮量对烤烟生长和氮素吸收的影响[J].植物营养与肥料学报,2007,13(3):436-442.

[31] 李春俭,张福锁,李文卿,等.我国烤烟生产中的氮素管理及其与烟叶品质的关系[J].植物营养与肥料学报,2007,13(2):331-337.

[32] 王新发,杨铁钊,殷全玉,等.氮用量对烟叶质体色素及中性香气基础物质的影响[J].华北农学报,2010,25(1):185-189.

Effects of Nitrogen Application Level on the Antioxidant Defense System and Quality of Flue-cured Tobacco Leaves

LI Li-jian,WANG Tao,MAO Lan et al

(Qujing Branch of Yunnan Tobacco Company,Qujing,Yunnan 655000)

[Objective] To research the effects of nitrogen application level on the antioxidant defense system and quality of flue-cured tobacco leaves. [Method] Taking K326 as experimental materials,we researched the effects of different nitrogen application levels on active oxygen content,SOD activity,GR activity,APX activity,antioxidants content and chemical components in tobacco leaves. [Result] With the growth and ripening of tobacco leaves in fields,generation rate of O2-· and content of hydrogen peroxide of tobacco leaves presented increasing trend. Activities of SOD,GR and APX increased firstly,and then decreased. Content of AsA increased at early growth stage and decreased gradually at late growth stage. Nitrogen application level had significant effects on antioxidant defense system. The contents of free radical scavenger (GSH,AsA) and activity of related enzymes (SOD,GR,APX) of antioxidant defense system at high nitrogen level were significantly or extremely significantly higher than those at low nitrogen level. With the increasing of nitrogen application level,the contents of nitrogen compounds of cured tobacco leaves increased significantly,while degradation amount of macro molecular substance decreased,such as protein,starch,chlorophyll and carotenoid,and the content of petroleum ether extract also reduced. However,it showed no significant impacts on potassium and chlorine. Thus,the quality of tobacco leaves reduced. [Conclusion] In field management of flue-cured tobacco,rational application of nitrogen fertilizer (45.0 kg/hm2) is beneficial to keep the higher activity of antioxidant defense system to resist stress at early growth stage,mature timely at mature period,and improve the quality of tobacco leaves.

Flue-cured tobacco; Nitrogen; Antioxidant defense system; Chemical components

中国烟草公司云南省公司项目(2014YN23)。

李利建(1972- )，男，云南曲靖人，助理农艺师，硕士，从事烟草生产与收购管理研究。

2016-11-09

S 572

A

0517-6611(2016)36-0035-04