盐酸氨基葡萄糖对膝骨关节炎膝关节软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素表达的影响*

张 晨，马 骏，吕雷锋，班文瑞，张二洋，党晓谦，王坤正

西安交通大学第二附属医院骨一科 西安 710004△男，1982年11月生，博士，副研究员，主治医师，研究方向：骨坏死疾病的基础与临床研究，E-mail：osteozhang@163.com

盐酸氨基葡萄糖对膝骨关节炎膝关节软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素表达的影响*

张 晨△，马 骏，吕雷锋，班文瑞，张二洋，党晓谦，王坤正

西安交通大学第二附属医院骨一科 西安 710004△男，1982年11月生，博士，副研究员，主治医师，研究方向：骨坏死疾病的基础与临床研究，E-mail：osteozhang@163.com

Ⅰ型胶原；骨钙素；骨关节炎；膝；盐酸氨基葡萄糖

目的：探讨盐酸氨基葡萄糖对膝骨关节炎膝关节软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素表达的影响。方法：选取46例因膝关节骨性关节炎行人工膝关节表面置换术的绝经后女性患者，其中23例术前半年内行盐酸氨基葡萄糖治疗12周，为观察组，未服用者23例为对照组。术中留取2组膝关节胫骨平台截骨后软骨下骨组织0.5 cm3，分别行骨组织显微CT检测、Ⅰ型胶原胶原苦味酸-天狼星红染色、骨钙素免疫组化染色、Ⅰ型胶原及骨钙素Western blot检测。结果：经显微CT检测发现，观察组软骨下骨小梁相对骨体积、骨小梁间隙、骨小梁厚度、骨小梁数目均较对照组有所改善，且观察组Ⅰ型胶原和骨钙素含量均较对照组增加(P<0.05)。Western blot检测亦证实观察组软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素表达较对照组增多(P<0.05)。结论：盐酸氨基葡萄糖可能通过调节Ⅰ型胶原及骨钙素的表达，从而改善女性膝关节骨性关节炎绝经患者膝关节软骨下骨的微结构，进而改善膝关节软骨下骨功能。

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以膝关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，其病理特点为局灶性关节软骨的退行性变，软骨下骨质变密，边缘性骨软骨骨赘形成和关节畸形[1]。近来研究[2-3]发现，KOA早期已经出现软骨下骨转化水平增强和骨小梁结构改变，软骨下骨在骨关节炎的发生发展中发挥着重要作用。因此有关软骨下骨修复的研究已成为KOA研究的热点。骨修复包括骨基质的形成及骨的矿化。在骨的有机质中，Ⅰ型胶原含量最高，在骨组织钙盐矿化过程中起支架作用[4-5]。Ⅰ型胶原的含量及结构的改变均能影响骨质的强度及韧性。骨钙素作为一种反映骨更新率的指标，具有调节骨组织能量代谢的作用，在骨矿化高峰期出现聚集[6-7]。目前，临床多选择口服氨基葡萄糖类药物改善关节软骨的代谢。该研究选择盐酸氨基葡萄糖治疗KOA，通过观察软骨下骨小梁微结构、Ⅰ型胶原及骨钙素的变化，探讨KOA软骨下骨的修复机制，为临床诊疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 主要试剂及仪器 EDTA-2Na(西安交通大学医学院实验中心)，骨钙素多克隆抗体、Ⅰ型胶原多克隆抗体及二抗(Abcam公司，美国)，放射免疫沉淀法(RIPA)总蛋白提取试剂盒(TaKaRa公司,日本)，丙烯酰胺、双丙烯酰胺、考马斯亮蓝(Amresco公司，美国)，ECL化学发光试剂盒(BIO-TEK公司，美国)，SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)，胶原苦味酸-天狼星红染色试剂盒(南京森倍加生物科技，中国)，eXplore Locus SP型显微CT(GE公司，美国)。

1.2 研究对象的选取和分组 该研究为病例对照研究。所有受试者均为陕西省西安市的汉族绝经女性，个体间无遗传学关系，且在3代之内没有家族迁徙史。所有受试者半年内无骨质疏松相关药物治疗史、无骨代谢类疾病或相关药物服用史。考虑到肥胖是骨性关节炎的易感因素之一，作者参考亚洲人群体重指数(body mass index，BMI)的总体水平，在研究中排除了BMI≥27 kg/m2的个体。根据以上标准，自2014年3月至2015年6月，共从作者所在医院骨一科住院患者中收集年龄在65～70岁因KOA行人工膝关节表面置换术且术前半年内服用盐酸氨基葡萄糖(商品名：步迈新)治疗(750 mg/次，2次/d)12周的女性患者23例(观察组)；收集同期基线资料相匹配的年龄在65～70岁因KOA行人工膝关节表面置换术但术前半年内未服用盐酸氨基葡萄糖治疗的女性患者23例(对照组)。所有参与者签署书面知情同意协议，该研究获西安交通大学医学伦理委员会批准。所有入组病例于术前采集基线资料，包括年龄、身高及体重，计算BMI、HSS评分、WOMAC评分及KSS评分。

1.3 标本采集及处理 2组患者均由同一主刀医生行人工膝关节表面置换术。术中留取膝关节胫骨平台截骨后软骨下骨组织0.5 cm3。每组中8例标本即刻置于甲醛溶液中保存，行显微CT检测；8例标本即刻置于甲醛溶液中固定3 d，后于EDTA脱钙液中脱钙，石蜡包埋切片行胶原苦味酸-天狼星红及骨钙素免疫组化染色；7例标本即刻液氮冷冻行Ⅰ型胶原及骨钙素的Western blot检测。

1.4 显微CT检测 各组软骨下骨标本置于样品杯中心轴线，并利用Scan Control软件实施标本扫描，应用美国GE公司eXplore Locus SP型显微CT行软骨下骨CT扫描，扫描分辨率14 μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kV，电流80 μA，曝光时间2 960 ms，帧平均数为4，像素组合为1×1。应用Reconstruction Utility软件进行标本重建，然后选择合适的定义框，应用MicroView软件对重建标本进行三维表现与观察，最后，应用骨形态分析软件Advanced Bone Analysis对定义框内的骨质行骨小梁相对骨体积、骨小梁间隙、骨小梁厚度及骨小梁数目检测。重复3次。

1.5 免疫组化染色法检测软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素的表达 收集各组待检测的股骨头标本，用PBS冲洗后置于体积分数10%中性甲醛溶液(0.1 mol/L,pH 7.4)内固定3 d，之后置于体积分数15%EDTA缓冲液中脱钙，每2 d更换1次脱钙液。待组织脱钙完全后，逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm厚切片，置于多聚赖氨酸处理的载玻片上，置于60 ℃烤箱2～3 h后，移入37 ℃烤箱过夜。首先按胶原苦味酸-天狼星红染色试剂盒步骤行Ⅰ型胶原染色，偏光显微镜下观察；然后行免疫组化SP法染色，应用鼠抗人骨钙素多克隆抗体检测骨钙素的表达。检测结果经光镜下拍照后运用FR-200紫外与可见光分析装置图像分析系统测量图像灰度，分析积分光密度并行统计学分析。重复3次。

1.6 Western blot法检测软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素的表达 收集各组软骨下骨，迅速放入含有液氮的研钵中研碎，加入RIPA裂解液在冰上匀浆，待充分裂解后，提取总蛋白。应用Western blot检测软骨下骨Ⅰ型胶原及骨钙素表达。利用FR-200紫外与可见光分析装置图像分析系统对电泳结果进行图像灰度分析。重复3次。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0处理数据。采用两独立样本t检验或校正t检验比较2组各指标的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组患者基线资料比较 见表1。

表1 2组患者基线资料比较

2.2 Micro-CT形态计量学测定 结果见表2。

表2 2组Micro-CT扫描参数分析

*：校正t检验。

2.3 胶原苦味酸-天狼星红染色结果观察 根据胶原的单轴双折光性，Ⅰ型胶原在苦味酸-天狼星红染色中呈现红色，Ⅲ型胶原呈现绿色。染色结果示对照组骨小梁已失去正常结构，胶原纤维排列紊乱，Ⅰ型胶原表达量少，Ⅲ型胶原表达较多(图1A)；观察组可见骨小梁增厚，仍可见胶原连续性中断，但较对照组改善(图1B)。2组膝关节软骨下骨Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达见表3。

A：对照组；B：观察组。图1 膝关节软骨下骨胶原苦味酸-天狼星红染色(×200)

2.4 骨钙素免疫组化染色观察 骨钙素阳性表达为棕黄色，位于骨髓及成骨细胞周围，骨小梁偶见阳性表达。对照组骨中骨钙素呈弱阳性表达，骨小梁周围成骨细胞罕见阳性表达(图2A)；观察组骨中骨钙素呈阳性表达，骨小梁周围成骨细胞也可见阳性表达(图2B)。2组膝关节软骨下骨骨钙素的表达见表3。

A：对照组；B：观察组。图2 2组膝关节软骨下骨骨钙素免疫组化染色(×200)

表3 2组膝关节软骨下骨Ⅰ、Ⅲ型胶原及骨钙素的表达 %

*：校正t检验。

2.5 Western blot检测结果 见图3、表4，由图3、表4可知，对照组及观察组均可见Ⅰ型胶原及骨钙素的表达，对照组Ⅰ型胶原、骨钙素表达低于观察组。

1：对照组；2：观察组。图3 Western blot检测结果

组别nⅠ型胶原骨钙素对照组737．26±6．540．18±0．08观察组780．32±8．620．62±0．11t28．49021．390P<0．001<0．001

3 讨论

KOA是一种以膝关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。以往多认为骨关节炎始自关节软骨细胞合成蛋白多糖的减少, 并逐渐发展为胶原纤维结构改变, 最终导致关节软骨退变[8-10]。然而，近年来有研究[11]认为在骨关节炎发病中软骨下骨起着重要作用；骨关节炎早期关节软骨退变之前,软骨下骨已经出现弹性模量减低、骨量减少的改变。

盐酸氨基葡萄糖的主要成分2-氨基-2脱氧-葡萄糖盐酸盐是一种天然的小分子氨基多糖，是蛋白多糖合成的前体物质[12]。目前研究[13-15]表明，氨基葡萄糖是蛋白多糖的构成成分，它可同时促进关节软骨基质中胶原的合成、提高软骨细胞的修复能力、促进软骨基质的修复和重建，从而延缓骨关节疼痛的病理过程和疾病的进程，改善关节活动度，缓解疼痛，延缓和改变骨关节炎的病理进程。因此，有关诊治指南[16]推荐盐酸氨基葡萄糖作为KOA治疗的一线用药。然而，针对氨基葡萄糖对软骨下骨结构影响的研究较少，其具体作用机制尚未阐明。

显微CT扫描结果表明治疗组软骨下骨骨小梁相对骨体积、骨小梁间隙、骨小梁厚度、骨小梁数目均较对照组有所改善，推测氨基葡萄糖在促进软骨下骨骨形成及矿化过程中起到了积极的作用。

在正常骨组织中，Ⅰ型胶原约占骨基质有机物质的90%以上，其余为少量的Ⅲ型、微量的Ⅴ型及Ⅹ型胶原。Ⅰ型胶原的网状结构决定了其经钙盐矿化后能够提供强有力的支撑，其含量的改变决定了骨的强度与韧性。该研究结果显示，对照组及观察组Ⅰ型胶原均存在断裂、粗细不等的改变，并可见Ⅲ型胶原的填充。观察组Ⅰ型胶原含量较正常稍有下降，而对照组明显低于观察组。推测KOA的软骨及软骨下骨结构的改变可能与Ⅰ型胶原含量及结构的失稳引起矿化作用减弱，骨小梁稀松，最终导致骨质疏松微观改变，在膝关节负重状态下微结构塌陷有关。而观察组在一定程度上，通过氨基葡萄糖的作用促进关节软骨下骨基质中胶原的合成，以及软骨下骨基质的修复和重建，起到了一定的治疗作用。

骨钙素是成骨细胞分化的重要标记因子以及矿化和骨形成中至关重要的分泌蛋白，其在骨组织中含量较为丰富，主要作用是通过矿化作用与羟基磷灰石结合。该研究结果显示，对照组膝关节软骨下骨中骨钙素含量下降，其可能的机制为关节软骨下骨受损，骨细胞及成骨细胞活性降低使骨钙素分泌减少。该研究结果表明，氨基葡萄糖可使软骨下骨骨钙素分泌增多，关节软骨下骨的支撑能力增强，从而起到了一定的治疗作用。

综上所述，KOA软骨下骨的生物力学改变是KOA发病过程中重要的病理学过程，其中Ⅰ型胶原及骨钙素的表达异常与其具有一定的关系。盐酸氨基葡萄糖能有效改善绝经女性KOA患者膝关节软骨下骨微结构，可能通过调节Ⅰ型胶原及骨钙素表达，实现改善膝关节软骨下骨功能的目的。但该研究未在基因层面进行研究，未进一步探讨Ⅲ型胶原的改变，仍需在后续研究中对相关机制进行深入研究。

[1]ARDEN NK,CRO S,SHEARD S,et al.The effect of vitamin D supplementation on knee osteoarthritis, the VIDEO study: a randomised controlled trial[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(11):1858

[2]刘明,余曦,黄富国,等.组织工程双相支架修复关节软骨及软骨下骨缺损研究进展[J].华西医学,2014,29(4):783

[3]李西海,梁文娜.软骨下骨骨重塑与骨关节炎的关系[J].国际骨科学杂志,2007,28(1):35

[4]PARK YJ,JUNG IH,KIM YK,et al.Guided bone regeneration using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)-cross-linked type-Ⅰ collagen membrane with biphasic calcium phosphate at rabbit calvarial defects[J].Biomater Res,2015,19:15

[5]MANLEY E JR,PEROSKY JE,KHOURY BM,et al.Thrombospondin-2 deficiency in growing mice alters bone collagen ultrastructure and leads to a brittle bone phenotype[J].J Appl Physiol(1985),2015,119(8):872

[6]OKAMURA H,YOSHIDA K,OCHIAI K,et al.Reduction of protein phosphatase 2A Cα enhances bone formation and osteoblast differentiation through the expression of bone-specific transcription factor osterix[J].Bone,2011,49(3):368

[7]郭晓强. 骨钙素:一种重要的能量代谢调节激素[J]. 生命科学,2011,23(1):102

[8]姜俊良,周予婧,林海丹,等. 膝骨关节炎运动疗法国内研究进展[J]. 华西医学,2015,30(12):2373

[9]DEEP K,PICARD F,CLARKE JV.Dynamic knee alignment and collateral knee laxity and its variations in normal humans[J].Frontiers Surg,2015,2:62

[10]LI Q,DUAN WP,CAO XM,et al.Case-control study on the relationship between body mass index and lower limb alignment of patients with knee osteoarthritis[J].Zhongguo Gu Shang,2011,24(11):911

[11]ZHEN GH,CAO X.Targeting TGFβ signaling in subchondral bone and articular cartilage homeostasis[J].Trends Pharmacol Sci,2014,35(5):227

[12]BLIDDAL H,CHRISTENSEN RD,KRISTENSEN PK,et al.Glucosamine effectiveness in the treatment of knee osteoarthritis. Presentation of a Cochrane analysis with the perspective on the GAIT trial[J].Ugeskr Laeger,2006,168(50):4405

[13]HENROTIN Y,MARTY M,MOBASHERI A.What is the current status of chondroitin sulfate and glucosamine for the treatment of knee osteoarthritis?[J].Maturitas,2014,78(3):184

[14]KANG YH,PARK S,AHN C,et al.Beneficial reward-to-risk action of glucosamine during pathogenesis of osteoarthritis[J].Eur J Med Res,2015,20:89

[15]HENROTIN Y,LAMBERT C.Chondroitin and glucosamine in the management of osteoarthritis: an update[J].Curr Rheumatol Rep,2013,15(10):361

[16]中华医学会骨科学分会.骨关节炎诊治指南:2007年版[J].中华关节外科杂志(电子版),2007,1(4):281

(2016-04-25收稿 责任编辑徐春燕)

Effect of glucosamine hydrochloride on type I collagen and osteocalcin level in knee subchondral bone of patients with osteoarthritis

ZHANGChen,MAJun,LYULeifeng,BANWenrui,ZHANGEryang,DANGXiaoqian,WANGKunzheng

DepartmentofOrthopedics,theSecondAffiliatedHospital，Xi′anJiaotongUniversity,Xi'an710004

type Ⅰ collagen;osteocalcin;osteoarthritis;knee;glucosamine hydrochloride

Aim: To research the effect of glucosamine hydrochloride on type Ⅰcollagen and osteocalcin level in knee subchondral bone of patients with knee osteoarthritis.Methods: Forty-six postmenopausal female patients with knee osteoarthritis underwent TKA surgery were allocated into 2 groups, those accepted glucosamine hydrochloride oral administration for 12 weeks during the half year before surgery were observation group, and those without the glucosamine hydrochloride treatment were control group. The subchondral bone tissue(0.5 cm3) of tibial in the 2 groups was collected and detected by micro-CT, collagen picric acid sirius red staining, osteocalcin immunohistochemical staining, as well as collagen Ⅰ and osteocalcin Western blot detection. Results: Compared with control group, the relative bone volume, intertrabecular spaces, trabecular thickness and numbers of trabecular all improved in the observation group. According to collagen picric acid sirius red staining and immunohistochemical staining, the contents of type Ⅰ collagen and osteocalcin in the observation group were higher than those in control group(P<0.05). According to the results of Western blot，the expression levels of type Ⅰ collagen and osteocalcin in the observation group were higher than those in control group(P<0.05).Conclusion: Glucosamine hydrochloride can effectively improve the subchondral bone microstructure and function of knee in female patients with knee osteoarthritis by regulating the expressions of type Ⅰ collagen and osteocalcin in subchondral bone tissue.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.003

*国家自然科学基金资助项目 81301562；西安交通大学第二附属医院人才培养专项科研基金 RC(XM)201501

R684