Cbl-b基因介导T细胞免疫杀伤小鼠LA795肺腺癌细胞的实验研究

黄海涛 张华



Cbl-b基因介导T细胞免疫杀伤小鼠LA795肺腺癌细胞的实验研究

黄海涛1张华2

目的 利用特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默T细胞Cbl-b基因表达，观察转染T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤作用。方法 筛选高效特异性沉默Cbl-b基因的siRNA序列转染T739小鼠脾脏T细胞，转染72h后，利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IL-2、INF-γ等T细胞免疫因子分泌情况，比较单纯T细胞、阴性对照T细胞及转染T细胞与小鼠肺腺癌细胞LA795混合培养肿瘤杀伤率。结果转染72h后，转染组细胞因子IL-2、INF-γ分泌水平较空转组和空白组显著增加。在体外实验中，与单纯T细胞及阴性对照T细胞相比，转染T细胞能更高效杀伤小鼠肺腺癌细胞LA795，最高杀瘤率达到58.38±3.82%。结论 利用特异性siRNA技术沉默Cbl-b基因能够促进小鼠T细胞因子IL-2和INF-γ分泌，增强T细胞对肺腺癌细胞LA795的体外免疫杀伤作用。

Cbl-b；基因沉默；T淋巴细胞；肺腺癌；免疫疗法

肺癌是临床上最常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居男性恶性肿瘤首位，女性恶性肿瘤第二位[1]。肺腺癌属于非小细胞癌，多数起源于支气管黏膜上皮，晚期肺腺癌通过淋巴及血液等途径全身多处转移，多数已不适合手术切除，且放化疗不能显著提高肺癌总体生存期，耐药现象普遍，难以得到持久缓解，患者远期预后差[2]。与其他肿瘤类似，肺癌发生发展与机体免疫系统功能密切相关，发病个体均存在有不同程度的抗肿瘤免疫缺陷。研究发现，约30%-50%非小细胞肺癌表达黑色素瘤抗原MAGE-A3，肺癌组织内细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤组织的渗透活性明显减弱，免疫抑制细胞活性增强，肿瘤局部微环境处于免疫抑制状态[3]。已有多种相关临床试验表明，非小细胞肺癌患者给予CTLA-4单克隆抗体或黑色素瘤抗原MAGE-A3疫苗治疗，可有效激活体内T淋巴细胞抗肿瘤免疫，其总体生存期和无进展生存期均优于安慰剂组，且机体耐受良好[4-5]。Cbl-b蛋白是近年来发现的一种E3泛素链接酶，与T细胞活化和免疫耐受直接相关，可负性调节T细胞活化信号转导通路，诱导机体对肿瘤免疫耐受[6]。已有动物实验研究表明，Cbl-b基因敲除小鼠能在缺失CD28协同刺激分子的情况下，直接活化T细胞，促进细胞因子IL-2, IL-17和IFN-γ分泌，显著增强机体抗肿瘤免疫活性[7-8]。国内有学者实验结果表明，利用小干扰RNA技术沉默Cbl-b基因能显著增强C57小鼠脾脏T淋巴细胞免疫活性[9]，这为以Cbl-b为靶向进一步免疫治疗肿瘤提供了良好的思路。在本实验中，我们同样利用小干扰RNA技术沉默Cbl-b基因表达，体外观察转染并沉默Cbl-b基因后，T细胞对小鼠肺腺癌细胞LA795的免疫杀伤作用。

资料与方法

一、实验动物与细胞

T739小鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司，SPF级，4-6周龄，体重约15-20g。利用小鼠T细胞富集磁珠(BD Biosciences，USA)分离T739小鼠脾脏T细胞，T细胞纯度能达到94.27%，培养基成分：90%1640培养基+10%胎牛血清+5μg/mL刀豆蛋白+1%双抗。小鼠肺腺癌细胞LA795来源于T739近交系小鼠自发乳头型肺腺癌，购于上海中国科学院细胞库，培养基成分：90%1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗。

二、Cbl-b siRNA设计与合成

进入pubmed检索界面，查询T739小鼠Cblb-mRNA序列，利用siRNA在线设计软件(siRNA Target Finder)筛选针对Cbl-b基因的4条潜在siRNA靶序列，具体如下：siRNA-1(有义链) 5-ACGCAAGCUUCAGUUGAAAtt-3’，(模板链)5’-UUUCAACUGAAGCUUGCGUtt-3’；siRNA-2(有义链)5’-GCGAUAUUUAACCGGAUUAtt-3’，(模板链)5’-UAAUCCGGUUAAA UAUCGCtt-3’；siRNA-3(有义链)5’-GCAUAUCAUUGCCAUAAUAtt-3’，(模板链)5’-UAUUAUGGCAAUGAUAUGCtt-3’；siRNA-4(有义链)5’-AGAGAGGCCCUGAUAUUACtt-3’，(模板链)5’-GUAAUAUCAGGGCCUCUCUtt-3’。上述siRNA序列均由上海吉凯基因技术有限公司设计并合成。

三、siRNA转染T淋巴细胞

原代T细胞接种于6孔板中，当细胞融合度达到90%后，用PBS缓冲液清洗3遍，Opti-MEM培养基轻柔吹打并重悬，按照细胞密度为1-2×105个/mL接种于48孔板，每孔200μL。设置转染组、空转组、空白组共3组，其中转染组将4条合成siRNA序列和LipofectamineTM 2000脂质体分别溶于20μL opti-MEM培养基中，siRNA和LipofectamineTM 2000脂质体含量分别为3μL和1μL，总体积终浓度为100nmoL/L，放置于室温中10min。10min后，轻柔混匀，共同孵育25min，然后将转染混合物加入48孔板T细胞悬液中，置于37℃条件下孵育6-8h，最后加入60μL胎牛血清继续培养。空转组中每孔则加入上述等体积LipofectamineTM 2000脂质体和阴性对照siRNA序列，空白组则仅加入等量opti-MEM培养基，其余处理同转染组。

四、Western blot检测Cbl-b蛋白表达水平

依照上述方法转染T细胞后继续培养48h后收集细胞，1500rpm离心5min，予以生理盐水清洗2遍，全蛋白提取试剂盒提取各分组T细胞总蛋白，lowry法测定总蛋白浓度，取蛋白样品30-50μg对各分组Cbl-b蛋白表达量进行检测和对比，转PVDF膜80V 60min后，TBST稀释的5%BSA在37℃中封闭1h，加入兔抗小鼠单克隆Cbl-b抗体(1：800稀释)4℃孵育过夜，加入HRP标记羊抗兔单克隆二抗(l：1000稀释)室温孵育45min，定影显色在ECL显色系统中完成，观察和分析杂交条带。

五、ELISA检测IL-2、INF-γ分泌变化

转染72h后，收集上述各分组T细胞上清液，酶标板中分别加入标准品、稀释液和待测样品，每孔100μL，每组设3个复孔。37℃培养箱中反应2h，加入100μL生物素抗小鼠细胞因子IL-2、INF-γ抗体工作液，37℃温度培养箱中避光孵育1h。加入亲和素过氧化物酶复合物的ELISA工作液100μL，37℃避光孵育30min。每孔加入50μL TMB显色液，37℃避光孵育30min，加入100μL终止液，450nm波长，酶标仪测定各孔平均光密度值(OD值)。

六、肿瘤杀伤率测定

转染T细胞24h后，将转染组、空转组、空白组T细胞分别与小鼠LA795肺腺癌细胞共培养，效靶比分别设置为40:1、20:1、10:1，接种于96孔板，每组各设置3个复孔，体积各为100μL。另外，将单纯T细胞和单纯LA795肺腺癌细胞作为杀伤细胞组和目标细胞组，每孔100μL。细胞共培养72h后，CCK-8试剂盒测定和统计分析各分组T细胞肿瘤杀伤率。肿瘤杀伤效率计算公式如下：

肿瘤细胞杀伤率(%)=((ODE+ODT)-ODE+T)/ODT×100%

ODE+t=杀伤细胞+目标细胞孔OD值

ODE=单独杀伤细胞的OD值

ODt=单独目标细胞的OD值

七、统计学分析

结 果

一、转染T细胞Cbl-b蛋白表达

T细胞转染48h后，Western blot检测各分组Cbl-b蛋白表达水平，4条siRNA序列对Cbl-b蛋白表达的抑制效率分别为81%、53%、27%、16%，而空转组与空白组间无统计学差异，其中siRNA-1序列在蛋白水平抑制效率最高，达到81%，这表明设计合成的siRNA-1序列能在蛋白水平高效并特异性抑制LA795肺腺癌细胞Cbl-b表达(见图1)，可用于后续实验。

图1 不同siRNA组Cbl-b蛋白表达

二、T细胞因子IL-2、INF-γ分泌水平

转染T细胞72h后，利用ELISA法检测各分组细胞上清液中细胞因子IL-2和INF-γ分泌水平，与空转组和空白组相比，转染组IL-2水平显著升高(*P<0.001), 转染组INF-γ水平有一定程度增加(**P=0.0014)，上述差异均具有统计学意义(见图2)。

三、沉默Cbl-b基因增强T细胞对LA795细胞免疫杀伤能力

转染T细胞与LA795肺腺癌细胞共同培养72h后，转染组T细胞杀瘤活性较空转组及空白组T细胞增加，差异具有统计学意义(*P=0.033,**P=0.024,***P=0.025)，值得注意的是，T细胞对LA795肺腺癌细胞杀伤率与细胞靶效比呈线性关系，即T细胞对LA795肺腺癌细胞杀伤率随着靶效比升高而随之增加，转染组T细胞的肿瘤杀伤效率在效靶比为40:1时达到最高，为58.38±3.82%(见图3)。

图2 转染48h细胞因子分泌变化

图3 共同培养72h后测定肿瘤杀伤效率(%)

讨 论

机体免疫功能低下与肿瘤发生发展密切相关，通过活化免疫细胞或免疫系统来抗肿瘤免疫治疗，一方面能刺激T细胞增殖活化杀灭肿瘤细胞，另一方面能促进机体产生对肿瘤细胞的免疫记忆和免疫监视能力，从而防止肿瘤复发[10]。肺癌病理机制与机体免疫密切相关，已有研究表明肺癌细胞表面I类人白细胞抗原(HLA-I)的表达降低或者缺失，致其不能被树突状细胞有效识别[11]。另外，肺癌细胞能主动分泌TGF-β、PGE2、IL-10、COX-2及Toll样受体等免疫抑制因子诱导机体免疫耐受[12]。T细胞通过介导细胞免疫直接杀伤肿瘤细胞，在机体抗肿瘤免疫过程中扮演关键作用[13]，而Cbl-b蛋白在T细胞活化和增殖过程中均起着重要的负性调节作用。研究表明Cbl-b基因敲除的 CD+4和CD+8T淋巴细胞均能在相当程度上抵消CD+4CD+25调节性T细胞和TGF-β介导的免疫抑制作用[14-15]。因此，Cbl-b蛋白的免疫负性调控作用为免疫激活T细胞治疗晚期肺腺癌提供了可能。

在本实验中，我们首先在各分组中加入CD3单克隆抗体,后者能特异地识别T细胞表面TCR/CD3复合体，刺激活化T细胞第一信号，而小干扰RNA沉默Cbl-b基因表达后发现T淋巴细胞的活化无须共刺激分子辅助，转染组T细胞因子分泌水平显著增加。细胞因子是由机体免疫细胞分泌的一种能调节细胞功能的小分子多肽，能激活人体抗肿瘤免疫功能，进而参与杀灭和控制肿瘤细胞。实验结果表明，转染T细胞72h后，细胞上清液中细胞因子IL-2和INF-γ分泌水平较空转组和空白组均显著升高，这表明沉默Cbl-b基因表达能促进T细胞活化。在体外免疫杀伤实验中，我们观察到siRNA沉默Cbl-b基因能增强T细胞对于肺腺癌细胞LA795的免疫杀伤作用，且杀伤力与靶效比存在正相关。活化的T细胞能识别肿瘤细胞表面肿瘤抗原肽，并通过死亡受体FasL/Fas介导肿瘤细胞凋亡、颗粒酶/穿孔素杀伤等多种途径清除肿瘤细胞。转染T细胞与靶细胞LA795肺腺癌细胞混合培养72h，在10:1、20:1、40:1的不同靶效比水平，转染组T细胞肿瘤杀伤率均比空转组和空白组T细胞高。当效靶比为40:1时，杀伤力最强，达到58.38±3.82%，这表明通过特异性小干扰RNA技术沉默T细胞Cbl-b基因表达以增强其对于肺腺癌细胞LA795的细胞杀伤作用是可以实现的，但是这种体外实验结果需要在动物实验中予以进一步证实。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] 杨怡敏,钱伟华,潘迎英.紫杉醇脂质体与紫杉醇联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床观察[J].解放军医药杂志,2013,25(6):50-52.

[3] Iyengar P, Gerber DE. Locally advanced lung cancer: an optimal setting for vaccines and other immunotherapies[J]. Cancer J,2013,19(3):247-262.

[4] Spigel DR, Greco FA, Waterhouse DM, et al. Phase II trial of ixabepilone and carboplatin with or without bevacizumab in patients with previously untreated advanced non-small-cell lung cancer[J]. Lung Cancer,2012,78(1):70-75.

[5] Lynch TJ, Bondarenko I, Luft A, et al. Ipilimumab in combination with paclitaxel and carboplatin as first-line treatment in stage IIIB/IV nonsmall-cell lung cancer: results from a randomized, double-blind, multicenter phase II study[J]. J Clin Oncol,2012,30:2046-2054.

[6] Liu Q, Zhou H, Langdon WY, et al. E3 ubiquitin ligase Cbl-b in innate and adaptive immunity[J]. Cell Cycle, 2014,13(12):1875-84.

[7] Stromnes IM, Blattman JN, Tan X，et al．Abrogating Cbl-b in effector CD8+ T cells improves the efficacy of adoptive therapy of leukemia in mice[J]．J Clin Invest,2010,120(10)：3722-3734．

[8] Paolino M，Thien CB，Gruber T，et al．Essential Role of E3 Ubiquitin Ligase Activity in Cbl-b-Regulated T Cell Functions[J]．J Immunol,2011,186(4)：2138-2147.

[9] 周术奎，史振铎，陈卫华，等．特异性小干扰RNA沉默Cbl-b基因增强小鼠脾脏T淋巴细胞的免疫活性[J]. 中华实验外科杂志，2013，30(6)：1207-1209.

[10] Marr LA, Gilham DE, Campbell JD, et al. Immunology in the clinic review series; focus on cancer: double trouble for tumours: bi-functional and redirected T cells as effective cancer immunotherapies[J]. Clin Exp Immunol,2012,167(2):216-225.

[11] Wu D, Kuiaste I, Moreau P, et al. Rescuing lymphocytes from HLA-G immunosuppressive effects mediated by the tumor microenvironment[J]. Oncotarget,2015,6(35):37385-37397.

[12] 张兰,李则学,刘海亮,等.抗肿瘤治疗对晚期肿瘤患者外周血CD4+/CD8+记忆T细胞亚群的影响[J].解放军医药杂志,2013,25(3):40-42.

[13] Li C, Li H, Jiang K, et al.TLR4 signaling pathway in mouse Lewis lung cancer cells promotes the expression of TGF-β1 and IL-10 and tumor cells migration[J]. Biomed Mater Eng,2014,24(1):869-875.

[14] Zhao YX, Guo H, Qiao G, et al. E3 Ubiquitin Ligase Cbl-b Regulates Thymic-Derived CD4+CD25+ Regulatory T Cell Development by Targeting Foxp3 for Ubiquitination[J]. J Immunol,2015,194:1639-1645.

[15] Qiao G, Zhao YX, Li ZP, et al. T cell activation threshold regulated by E3 ubiquitin ligase Cbl-b determines fate of inducible regulatory T cells[J]. J Immunol, 2013,191(2):632-639.

The experimental research about immunity killing of Cbl-b gene mediated T lymphocyte against Mouse LA795 lung neoplasms cells

HUANGHai-tao,ZHANGHua

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFifthPeople'sHospitalofChengdu,Chengdu,Sichuan611130,China

Objective To investigate the cytotoxicity activity of transfected T lymphocytes against LA795 lung neoplasms cells in vitro by utilizing specific small interfering RNA (siRNA) to silence the expression of casitas B cell lymphoma-b(Cbl-b) gene of T-Lymphocytes. Methods T lymphocytes were transfected by specific siRNA to silence the expression of casitas B cell lymphoma-b (Cbl-b) gene. 72 hours after transfection, the secretion of IL-2 and IFN-γ were measured by ELISA. In the end, the cytotoxicity activity changes against LA795 lung neoplasms cells were compared among transfected T lymphocytes, negative control and blank control in vitro. Results 72 hours after transfection, compared with the other groups, T lymphocytes transfected with siRNA showed higher secretion level of IL-2 and IFN-γ (P<0.05). Transfected T lymphocyte also showed more efficient killing ability against LA795 lung neoplasms cells than negative control and blank control in vitro. The highest killing rate reached 58.38±3.82%. Conclusion Silencing Cbl-b can significantly promote the secretion level of IL-2 and IFN-γ of mice T lymphocyte, and enhance the cytotoxicity activity of T lymphocyte against LA795 lung neoplasms cellsinvitro.

Cbl-b; gene silencing; T-Lymphocytes; lung neoplasms; adoptive immunotherapy

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.043

611130 四川 成都，成都市第五人民医院1.呼吸内科、2.消化内科

2016-06-22]