红花黄萎病病原菌鉴定

王成成, 岳永亮, 任毓忠, 张 莉, 金恭玺, 李国英

(石河子大学农学院,新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室,石河子 832003)

红花黄萎病病原菌鉴定

王成成, 岳永亮, 任毓忠, 张 莉, 金恭玺, 李国英*

(石河子大学农学院,新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室,石河子 832003)

2014年在石河子大学试验站和实验农场种植的红花出现了一种植株矮化,叶片发黄,枯死的病害,切开茎秆,维管束变成褐色。采用常规组织分离法对病组织茎秆进行分离、纯化获得单孢纯培养菌株;通过常规纸钵撕底沾根法对其进行致病性测定;用形态学和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定。结果表明,分离菌株的菌落形态、分生孢子梗和分生孢子的形态都与大丽轮枝菌Verticilliumdahliae一致;经分子生物学鉴定,该菌的rDNA-ITS序列与中国棉花黄萎病菌V.dahliae的ITS序列(登录号KT803074)同源性为99%以上 。故将引起新疆红花黄萎病的病原菌鉴定为大丽轮枝菌V.dahliae。

红花; 黄萎病; 病原鉴定

红花CarthamustinctoriusL.属于双子叶植物,菊科,红花属。在新疆种植面积较大,是一种经济价值很高的经济作物。其红花油中含有较高的亚油酸,具有降血脂、软化血管、增加血液循环的作用。其花不仅可作染料,同时也可药用,具有活血通经、化痰止痛的功效。红花油不仅是良好的食用油,也是良好的工业和医药用油。红花抗旱、抗寒,并且耐盐碱,适于中国北方及西北地区栽培。

新疆维吾尔自治区是我国重要的红花生产基地,无论种植面积、干花产量和红花籽产量都占全国的80%左右[1]。在新疆红花主要分布于塔城、伊犁和昌吉等地,是这些地区重要的经济和油料作物。自2013年以来,石河子大学农学院试验站和试验场种植的红花经常出现叶片发黄,植株矮化,甚至枯死,剖秆检查维管束变褐色,严重时发病率达15%。尤其在前茬为棉花且黄萎病发病重的田块,发病较重。在国外,Koike等[2]报道了美国加利福尼亚榨油红花和观赏红花发生黄萎病,有的地块发病率高达50%。植株由于品质丧失或植株死亡而不能收获。Koike等[2]将其病原鉴定为大丽轮枝菌Verticilliumdahliae。目前国内尚未发现这方面的报道。贾菊生等[3]报道新疆棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae人工接种可以侵染红花,但没有自然情况下导致红花发病的直接证据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的红花病株于2014年和2015年采自石河子大学农学院试验站和大学实验农场红花地中。人工接种所用红花种子为健康的‘裕民无刺’品种。通过田间病株和人工接种发病的病株进行症状描述。

1.2 病原菌分离纯化及致病性测定

2014年7月在田间采集症状典型的病株,弃去叶片，将茎秆切成小段,用1%的升汞表面消毒30 s,取出后连续用无菌水冲洗3次,之后置于马铃薯葡萄糖洋菜培养基上,27℃温箱中黑暗培养,待长出菌丝并进一步纯化培养后,按常规方法进行单孢分离,将单胞纯化菌株转接于试管斜面培养10 d后,4℃冰箱中保存,并以20%甘油孢子悬浮液保存于-70℃冰箱中备用。其致病性测定参照马存的纸钵撕底蘸根接种法进行[4],即选取直径12 cm的营养钵,其内装入无菌土,播入‘裕民无刺’红花品种的种子,放入25℃的温室,待幼苗长到6片真叶时,撕去营养钵底部(伤部分幼根),放入盛有孢子浓度为1×107个/mL的15 mL新鲜菌液中,以接种15 mL无菌水为对照,每个处理3钵,每钵10株苗,试验重复3次。10 d后开始对发病情况进行调查,并采集病样对病原菌进行再分离。

1.3 形态学鉴定

分离菌的形态鉴定,包括不同温度下菌落的生长情况和形态特征、微菌核产生情况、分生孢子梗和分生孢子的形态及其大小的显微测量和拍照等均参照岳永亮等[5]的方法进行。

1.4 分子生物学鉴定

1.4.1 基因组DNA提取

从分离纯化的菌株中选3个代表性菌株在PDA平板上25℃培养7 d,收集菌丝,采用CTAB法提取菌体的基因组DNA[6]。

1.4.2 rDNA-ITS区的扩增及测序

代表菌株rDNA-ITS区序列的PCR扩增选用真核生物通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′);PCR反应总体积25 μL,引物ITS1/ ITS4 0.4 μmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,10×PCR buffer 2.5 μL,TaqDNA聚合酶1U,DNA模板1 μL。用TECHNE TC-3000 PCR仪进行扩增,94℃ 3 min预变性;94℃,30 s;55℃,30 s;72℃,40 s;30次循环;72℃延伸10 min,扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,然后将PCR产物送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

1.4.3 rDNA-ITS序列分析

将测得的序列在NCBI数据库进行BLAST比对(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/),并与GenBank已登录的相似序列进行同源性分析,利用MEGA 5.0软件构建序列的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病害症状

红花黄萎病在田间一般于红花开花后开始发生,并很快进入发病盛期。植株叶片自下而上开始褪绿变黄,有些叶片褪绿不均,呈“花叶”状,严重者整株枯死。剖秆检查可见维管束变成褐色。室内人工接种后,一般10～15 d开始发病,叶片自下而上出现黄化,有些叶脉也明显变黄,发病后期常整个植株萎蔫,剖秆检查可见维管束变褐色。其人工接种症状和田间症状一致(图1)。

图1 红花黄萎病症状Fig.1 Symptoms of Verticillium wilt on safflower

2.2 致病性测定

室内植株人工接种10～15 d后, 叶片开始出现褪绿发黄症状,一个月后进入发病盛期,发病率在68%以上,未接种植株表现正常。从发病的红花组织上再分离得到与接种菌株相同形态的真菌。

2.3 形态学鉴定

病原菌在PDA培养基上培养16 d,其菌落均为圆形或近圆形。在10、15、20和25℃条件下培养,均产生微菌核,气生菌丝白色,不发达;在25℃生长最快,20℃次之;30℃不产生微菌核,菌落正面呈规则的放射状乳白色,背面米黄色;35℃下不生长(图2a)。普通光学显微镜观察,分生孢子梗无色透明,多由1～3层轮生小梗和一个顶枝小梗组成,每层有2～4个分枝(图2b),顶枝长度32.9～75.8 μm,平均长度55.8 μm;轮枝小梗长度10.4～87.2 μm,平均长度23.9 μm;轮层间距28.5～67.5 μm,平均为50.9 μm。分生孢子无色透明,椭圆形、卵形等,大小为(5.0～12.4)μm×(2.5～6.9)μm。微菌核念珠状、椭圆形、长圆形或不规则形(图2c),大小差别很大,一般(32.2～120.0)μm×(24.0～61.4)μm。与已报道的大丽轮枝菌(V.dahliae)一致。

2.4 分子生物学鉴定

3个代表性菌株(xj-1,xj-2,xj-3)的 rDNA-ITS区序列大小均为516 bp,将扩增产物的序列与GenBank中已登录的轮枝菌属不同来源分离物的核苷酸序列进行比对,并构建系统发育树。结果显示,来自新疆红花上的分离物的rDNA-ITS序列与已登录的大丽轮枝菌Verticilliumdahliae棉花、茄子、葡萄及芒果树分离物(登录号分别为EU835817.1、KJ696553.1、FJ475122.1和KF878396.1)的序列同源性达100%～99.77%,结合病菌的形态特征,将引起新疆红花黄萎病的病原鉴定为大丽轮枝菌Verticilliumdahliae。

图2 红花黄萎病病原菌的形态Fig.2 Morphology of the pathogen causing Verticillium wilt on safflower

3 结论与讨论

通过病害田间症状的系统观察,病菌的形态特征、培养性状和ITS序列的分析,以及致病性试验,结合国外有关资料,将引起新疆红花CarthamustinctoriusL.黄萎病的病原确定为大丽轮枝菌Verticilliumdahliae。

大丽轮枝菌所引起的黄萎病是一种典型的土传病害,具有寄主多、分布广、防治难的特点,常引起多种植物黄萎病[7]。作为重要的药用和油料作物,国内尚未见红花黄萎病的报道。目前新疆棉花黄萎病发生较重[8-9],为此在棉花黄萎病重病田轮作倒茬时不要种植红花,以免引起不必要的经济损失。

图3 基于ITS序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on the ITS sequences

[1] 王兆木, 陈跃华. 红花及其开发利用[J]. 新疆农业科学, 1995(5): 203-205.

[2] Koike S T.Baameur A, Maruthachalam K, et al.Verticilliumwilt of spineless safflower caused byVerticilliumdahliaein California [J]. Plant Disease, 2012, 96(9): 1383.

[3] 贾菊生,郭辉.新疆几株黄萎轮枝菌株的形态学鉴定与生物学特征特性比较研究[J].新疆农业大学学报,2006,29(3):73-77.

[4] 马存. 棉花枯萎病与黄萎病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2007: 61-106.

[5] 岳永亮,任毓忠,张莉,等.新疆榆树黄萎病的鉴定 [J].植物保护,2016,42(2):251-253.

[6] 沈萍, 陈向栋. 微生物学实验[M].第四版.北京: 高等教育出版社, 2010: 149-151.

[7] Pegg G F, Brady B L.Verticilliumwilts [M]. UK: CABI Publishing, 2002.

[8] 韩宏伟, 刘培源, 吉丽丽, 等. 新疆北部棉区棉花黄萎病菌病原种群致病性分化及变异[J]. 植物保护学报, 2011, 38(2): 121-126.

[9] 韩宏伟, 任毓忠, 刘培源, 等. 新疆南部棉区黄萎病菌种群致病性分化及变异[J]. 棉花学报, 2012, 24(2): 147-152.

(责任编辑：杨明丽)

Identification of the pathogen causingVerticilliumwilt on safflower

Wang Chengcheng, Yue Yongliang, Ren Yuzhong, Zhang Li, Jin Gongxi, Li Guoying

(AgriculturalCollegeofShiheziUniversity,KeyLaboratoryofXinjiangUygurAutonomousRegionforOasisAgriculturalPestManagementandUtilizationofPlantProtectionResource,Shihezi832003,China)

A disease causing leaf yellowing, stunting, and death on safflower was found at the Shihezi University Agricultural Experimental Station and Farm, Xinjiang Uygur Autonomous Region in 2014. Vascular bundles in the stem also became brown. The pathogenicity of the isolates was tested by using the root-dipping method in paper cups with the bottom torn out. The colony morphology, conidiophores, and conidia of the isolates were identical to those ofVerticilliumdahliae. Its rDNA-ITS sequence showed 99% homology with that of China cotton isolate ofV.dahliae(KT803074). It is supposed that this safflower disease was caused byV.dahliae.

safflower;Verticilliumwilt; pathogen identification

2016-01-16

2016-03-25

中小企业创新项目(14C26216513812);石河子科技局项目(2012NY04)

S435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.044

* 通信作者 E-mail: lgyshzu@163.com.