牛副流感病毒3型研究概述

冉旭华，张峣，闻晓波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛副流感病毒3型研究概述

冉旭华，张峣，闻晓波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

牛副流感病毒3型（BPIV3）是引起牛呼吸系统疾病的主要病原，广泛分布于世界养牛业发达地区，BPIV3常与其他病毒或细菌混和感染或继发感染，对养牛业造成巨大的经济损失。此文从BPIV3的分子结构、致病机制、免疫逃避、种间传播、病毒病诊断与防控等方面介绍BPIV3的研究概况，为该病毒的基础研究及相关疾病的防控提供参考。

牛副流感病毒3型；免疫逃避；种间传播；诊断；防控

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）隶属于副黏病毒科呼吸道病毒属，为不分节段的单股负链RNA病毒。BPIV3是牛呼吸道综合症（BRDC）的主要病原，大多数的BPIV3感染会造成急性的临床症状，对舍饲育肥牛的危害极大，每年均使全球的养牛业蒙受重大的经济损失。截至目前，BPIV3已发现3种基因型，即a、b及c型，在世界范围内的多个地区均有这3种基因型的分离报道，而目前我国主要流行毒株的基因型为a型及c型。

1 病毒的分子结构及基因型

1.1 病毒的分子结构

BPIV3完整病毒粒子为球形，直径150～200 nm，具有囊膜及核衣壳结构；基因组长约15 450 bp，共有编码9种蛋白质的6组基因，它们在基因组中的排列顺序为3'-NP-P/V/C/D-M-F-HN-L-5'。N蛋白在病毒粒子中含量较高且相对保守，可以有效诱导宿主产生免疫应答。磷蛋白P与病毒的3个非结构蛋白共用一个开放阅读框，在转录的过程中通过G的特异性插入实现V及D蛋白的编码，其中V蛋白会特异结合细胞受体MDA-5进而抑制干扰素的有效表达，产生免疫逃避[1]。NP、P和L 3种蛋白形成转录复合体，共同参与病毒RNA的转录和复制。保守的M蛋白在被BPIV3感染的细胞中含量最高，它位于囊膜内侧对于病毒的装配、出芽及子代病毒的释放都具有重要意义。位于囊膜表面的HN及F蛋白是副黏病毒主要的保护性抗原，与病毒传播及释放有关且两者存在协同作用[2]。

1.2 病毒的基因型

PCR技术出现之前，人们对BPIV3的研究主要集中于病毒形态、结构蛋白及血清中和保护抗体等方面。随着PCR测序技术及分子生物学技术的发展，人们对于BPIV3的研究逐渐深入到了基因层面。在2008年之前，人们普遍认为BPIV3仅有一个基因型，然而2008年发表的一篇文章报道了在澳大利亚分离的几株BPIV3基因组与之前已知的BPIV3基因在同源性上存在较大差异且处于两个不同的进化分支，故将此类毒株划分为一个新的基因型，即b基因型[3]。2011年，中国分离并报道了几株BPIV3分离株[4]，对其中一株病毒进行的全基因组测序及进化分析表明，该毒株不同于以往分离的a型及b型毒株，而是属于一个全新的c型家族，随后美国、韩国及阿根廷等地亦有该型毒株的分离报道。截至目前，BPIV3已发现并确定了3个不同的基因型，它们在基因结构上并无显著差别，只是在基因组总长度及部分氨基酸编码及非编码区存在差异而有限的研究表明不同基因型之间的血清中和抗体存在差异[5]。

2 BPIV3致病机制及免疫逃避

2.1 致病机制

目前关于副黏病毒的感染及致病机制已有广泛研究，但关于体内细胞受损的具体研究却相对较少。由于唾液酸受体广泛分布于呼吸系统，故在BPIV3感染的过程中会造成呼吸系统的多细胞感染，这些细胞包括支气管纤毛细胞、支气管无纤毛细胞、肺泡巨噬细胞以及Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞，其中肺泡巨噬细胞感染会影响机体的抗病毒免疫。利用表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组BPIV3，人们可以准确定位BPIV3在组织细胞中的分布[6]。然而，除了仅具有提示意义的形态学观察，目前尚无明确证据表明BPIV3相关的病理性变化是由细胞坏死、凋亡或程序性死亡导致的。

2.2 免疫逃避

与其他大多数病毒一样，副黏病毒在感染宿主细胞的过程中受到宿主细胞抗病毒效应的影响。对部分副黏病毒的研究表明，其自身编码的一些非结构蛋白在拮抗宿主先天性免疫方面起到至关重要的作用。目前对BPIV3非结构蛋白抑制宿主先天免疫的研究尚无报道。对猿副流感5型（SV5）的研究表明，其非结构蛋白V可通过抑制宿主细胞信号转导通路及转录活化蛋白（STAT）来降低干扰素的表达水平[7]。另外，对仙台病毒（SeV）C蛋白的研究发现，该蛋白会影响STAT的磷酸化及稳定性，干扰素的信号转导也会因此受到影响[8]。视黄酸诱导基因蛋白I （RIG-I）和黑色素瘤分化相关抗原5（mda-5）是细胞内识别外源双链RNA的固有免疫识别受体，可激活干扰素并提高细胞免疫应答水平。一系列的研究表明，副黏病毒非结构蛋白会特异的与这些受体结合，使其传导及激发干扰素的能力减弱，病毒借此实现免疫逃避[9]。

3 病毒的流行病学研究及种间传播

3.1 病毒的流行病学

在温带地区，BPIV3感染普遍发生于秋冬两季且常可继发其它急性呼吸道病原，其中牛传染性鼻气管炎[10]及溶血性巴氏杆菌等可使病牛产生严重的呼吸系统症状并诱发全身性败血症。病毒传播方式主要为呼吸道飞沫传播，鼻液、泪液等均可分泌病毒，且感染多发于拥挤的牛舍、交易市场及运输过程。BPIV3的最低感染剂量尚不明确，但应远低于病毒在鼻腔的分泌浓度（106～107.5TCID50/mL）[11]。BPIV3可在鼻腔中存活至少3 h以上，且温度较低时拥有更强的生存能力但自然条件下的病毒存活时间尚不得知。BPIV3感染的免疫应答时间尚不明确但血清阳性的牛首次感染BPIV3后仍可发生二次感染，二次感染后可能还会出现排毒现象，且持续时间要比首次感染时间短[10]。

目前BPIV3已呈全球性流行，多个大洲、国家及地区均有报道。随着我国加入WTO以后，畜牧产品交易频繁，这也为该病传入我国提供了可能性。我国于2008年，先后在黑龙江[12]、内蒙古[13]以及山东[4]等地分离到该病毒，以上证据表明不同基因型的BPIV3已出现于我国养牛业发达地区。随着我国养牛业的集约化发展，造成的养殖密度大、空气质量差等因素为该病症的传播和流行提供了可能，因此控制BPIV3的传播对预防牛呼吸道综合征的发生具有重要意义。

3.2 种间传播

除圈养肉牛及奶牛之外，BPIV3阳性抗体反应已在几种有蹄动物身上得到验证[11]，另外多种实验动物也可感染该病毒[14-15]。除有蹄动物及部分实验动物之外，BPIV3同样可以在灵长类动物及人身上进行复制[15]，但病毒的增殖能力被弱化。副黏病毒跨物种传播及种间抑制的特点使BPIV3具有开发为人用疫苗的潜力。

除陆地上的哺乳动物会感染BPIV3外，水生哺乳动物也存在感染PIV3的可能。最新的研究表明，在宽吻海豚身上分离得到的PIV3与b型BPIV3在进化上同属于一个分支，其中部分编码N、F及L蛋白的基因同源性最高可达99%[17]。鉴于BPIV3跨物种感染已有广泛报道，故据此推测从宽吻海豚身上分离到的PIV3可能源自牛源的BPIV3。

4 疾病诊断

4.1 血清学诊断及病原检测

早期的BPIV3诊断除临床诊断之外实验室诊断主要以血清学检测为主。血清中和试验（SN）、血凝抑制试验（HI）以及酶联免疫吸附试验（ELISA）通常选用分离到的全病毒颗粒以及部分结构蛋白为抗原用于检测血清中和抗体水平，相比于HI试验，ELISA试验在BPIV3的检测中展示了更高的灵敏度及良好的稳定性。随着分子生物学的快速发展，人们开发出了利用单克隆抗体（McAbs）进行病毒检测及生物学研究的新方法[18]，该方法除了具有极高的特异性之外还可以用于不同毒株之间特定抗原的差异性研究。以传统的血清学检测为基础，研究人员开发出了Luminex方法[19]，该方法以微球及流式细胞仪为技术支撑，利用荧光编码的微球及荧光素标记的检测抗体对特定的目标抗原进行检测，通过荧光强度来确定被测抗原的浓度进而达到检测目的，该方法可同时对多个目标抗原进行检测，且同时具备ELISA方法测量准确操作简便等优点。

4.2 基因检测

BPIV3与其他副黏病毒存在的交叉免疫反应使得该病毒的血清学检测增加了部分不确定因素，因此，利用基因方法对病毒基因直接进行测定具有更高的准确性。常规的基因检测方法是参考GenBank上已发表的标准序列设计特定的扩增引物以样品中待检抗原的基因组为模板进行RT-PCR扩增，通过观察扩增产物的大小及序列比较来最终确定所检样品的种类。然而，常规的RT-PCR方法仅能对样品中不同种类的抗原进行区分却不能对各抗原在样品中具体拷贝数及所占比例进行准确测定。为了解决这一问题，研究人员开发出了荧光定量PCR方法（qPCR），相比于传统的RT-PCR方法，qRT-PCR具有更高的灵敏性，可以做到对病毒的绝对定量[20]。

除上述检测方法之外，对BPIV3的诊断方法还包括电镜诊断[20]、免疫荧光诊断[21]以及环介导等温扩增技术（LAMP）[22]等。这些方法有的成本昂贵仅适用于实验室研究，有的仍处于开发阶段，但随着生产技术的不断完善，越来越多的检测手段将运用到BPIV3的研究中，这将更有利于该病防治工作的开展与实施。

5 疾病的治疗和疫苗研究

5.1 病毒的治疗

利巴韦林是一种广谱抗病毒核苷酸类似物，它也可以用于对抗副黏病毒。抗体治疗BPIV3的研究报道较少而干扰素抗病毒研究相对较多[23-24]。研究表明，人干扰素α-2a会影响BPIV3的糖蛋白合成及病毒装配[23]，运用间接免疫荧光实验及电镜探测等方法在体外直接观察到在干扰素的影响下病毒HN蛋白发生了运输障碍[23]。

除了良好的饲养条件及合理的转运方式，注射疫苗是预防BPIV3发生与传播的必要方式。早期的BPIV3疫苗以灭活苗及弱毒苗为主且多为对抗牛多种呼吸系统病原的联合疫苗。研究表明，BPIV3疫苗免疫一年后仍可在血清中检测到中和保护抗体且具有免疫记忆[25]。亚单位疫苗是继全病原体疫苗后产生的另一种疫苗，该疫苗的主要特点是只含有可以有效诱导机体产生免疫应答的抗原决定簇，避免了许多无关抗体的产生。研究人员利用杆状病毒表达系统对BPIV3囊膜表面的糖蛋白HN进行表达[26]，结果表明获得的重组蛋白可与BPIV3阳性血清发生特异性反应，该研究为更有效且廉价的BPIV3疫苗生产奠定了基础。

除上述两种疫苗外，核酸疫苗在预防BPIV3感染方面也具有一定发展潜力。给小鼠注射编码BPIV3糖蛋白的重组质粒会使小鼠产生有效的免疫应答且皮内注射诱导产生的血清抗体水平要高于肌内注射[27]。相比于传统疫苗，核酸疫苗具有更强的免疫保护力且制备简单，但质粒DNA可能诱导宿主自身免疫反应以及外源基因可能整合到宿主基因组中等潜在危险又限制了该类疫苗的开发与利用。

5.2 疫苗研究

病毒嵌合疫苗是运用分子生物学及基因工程等手段在基因水平上对病毒进行操作，构建能够表达两种以上病毒特异性抗原的基因工程疫苗，副流感病毒嵌合疫苗是目前的一项研究重点。最早的副流感病毒嵌合疫苗是以人副流感病毒3型（HPIV3）为载体进行构建的[28]。BPIV3与HPIV3同属于副黏病毒科的呼吸道病毒属，且二者具有血清学交叉反应，然而由于种间抑制的存在，BPIV3在灵长类动物及人类身上的复制增殖能力受到了限制，其中HN及F蛋白是限制BPIV3在灵长类动物身上复制的主要因素[29]。鉴于PIV3以上特点同时结合反向遗传技术等基因工程方法，研究人员将BPIV3及HPIV3部分基因（N、HN及F）的编码序列进行互换[30]，以期构建可用于对抗HPIV3的重组疫苗。除此之外，研究人员还以BPIV3为载体，成功构建可以表达呼吸道合胞体病毒（RSV）[31]与麻疹病毒（MV）[32]抗原蛋白的重组病毒，其中PIV3-MV重组毒可在灵长类身上有效诱导中和抗体的产生且对PIV3及MV的中和抗体滴度均超过1∶500。

6 展望

作为BRDC的主要病原，牛副流感病毒3型本身致病能力并不强，但在其他继发病原等外界因素的联合作用下，该病毒会导致牛产生严重的呼吸道症状，甚至引起病牛的死亡，因此该病正严重威胁着世界养牛业的发展。对我国BPIV3流行病学调查显示，该病毒已在多个省份广泛流行[33]，而目前国内尚无商业化的BPIV3疫苗，因此加强该病相关预防及治疗药物的开发与利用是接下来的研究重点。作为一种潜在的人用PIV3疫苗及病毒嵌合疫苗载体，BPIV3的研究正获得越来越多的重视，因此除了加强对该病毒的预防之外还要充分发挥该病毒的优势之处使其为人类的健康事业及畜牧产业的合理、快速发展提供安全保障。

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Review of Bovine Parainfluenza Virus Type 3

Ran Xuhua，Zhang Yao,Wen Xiaobo
（College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Bovine parainfluenza virus type 3（BPIV3）was the leading pathogen of bovine respiratory disease，which was tentatively divided into three genotypes.BPIV3 was widely distributed in cattle industry worldwide.The co-infection of the BPIV3 with other viruses and bacteria might cause huge economic loss to cattle industry.The molecular structure，pathogenic mechanism，immune evasion，interspecies transmission of BPIV3 and diagnosis，control and prophylaxis against the related disease were summarized in this review.It would provide a reference to the basic research and prevention and control for disease associated with BPIV3 infection.

bovine parainfluenza virus type 3；immune evasion；interspecies transmission；diagnosis；control and prophylaxis

S858.23

A

1002-2090（2017）03-0024-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.03.006

2016-04-29

黑龙江省农垦总局“十二五”重点科技计划项目（HNK125B-11-08A，HNK125B-11-02）；黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目（YJSCX2015-Y19）；“十二五”农村领域国家科技计划课题（2012BAD12B03-3）。

冉旭华（1978-），女，副教授，中国农业科学院毕业，现主要从事动物病毒分子免疫学的研究工作。

闻晓波，男，副教授，E-mail：xiaobo_wen@byau.edu.cn。