黄芪甲苷对早期骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-1表达的影响

刘建红 孟庆刚 胡佳卉 石康乐

(青海大学，青海 西宁 810016)

黄芪甲苷对早期骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-1表达的影响

刘建红 孟庆刚1胡佳卉1石康乐1

(青海大学，青海 西宁 810016)

目的 探讨黄芪甲苷作用于早期骨关节炎退变软骨细胞后基质金属蛋白酶(MMP)-1表达的变化。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度黄芪甲苷作用不同时间关节炎退变软骨细胞的存活率；qRT-PCR法检测黄芪甲苷不同浓度不同作用时间处理关节炎退变软骨细胞后MMP-1 基因表达情况；酶联免疫吸附(ELISA)法检测黄芪甲苷处理关节炎退变软骨细胞后细胞上清液中 MMP-1的表达；Western印迹检测黄芪甲苷处理后MMP-1蛋白表达。结果 黄芪甲苷处理后关节炎软骨细胞存活率提高，20～100 mmol/L浓度内呈剂量依赖，黄芪甲苷用量100 mmol/L效果最佳；随着培养时间的延长，细胞的存活率增加，在12 h～3 d内，第3天达到存活率最高。与对照组未经黄芪甲苷处理的软骨细胞相比，黄芪甲苷处理后的细胞中MMP-1基因表达量下降，黄芪甲苷浓度20～60 mmol/L，培养2 d内，MMP-1基因的表达量与黄芪甲苷的作用浓度与作用时间呈负相关；100 mmol/L时，第2天时MMP-1基因表达量最低。ELISA结果显示正常软骨组织中MMP-1少量表达，关节炎软骨组织中MMP-1的浓度为正常组织中的2倍，处理后正常软骨组织中 MMP-1浓度并未发生变化，黄芪甲苷处理后的关节炎软骨组织中MMP-1浓度降低为处理前的0.5倍，但仍高于正常软骨组织中MMP-1的浓度。Western印迹检测结果显示正常软骨组织中MMP-1蛋白少量表达，关节炎软骨组织中MMP-1蛋白大量表达，与对照组相比，黄芪甲苷处理后软骨组织中MMP-1蛋白表达量降低，但仍高于正常骨组织。结果 黄芪甲苷抑制早期骨关节炎退变软骨细胞与MMP-1表达下降相关。

黄芪甲苷；关节炎;退变软骨细胞；基质金属蛋白酶-1

膝骨关节炎(KOA)是一种慢性退行性骨关节病,关节软骨发生改变、关节间隙变小，从而引发骨质增生等疾病〔1〕。关节软骨的胞外基质由Ⅱ型胶原组成，主要支持和保护细胞〔2〕。基质金属蛋白酶(MMPs)是广泛存在于软骨中的蛋白酶家族,能降解关节软骨的胞外基质,当发生KOA时,软骨组织局部MMPs表达量升高，破坏细胞外基质的平衡状态,导致软骨逐渐出现糜烂、溃疡增生等一系列退行性变化〔3〕。黄芪甲苷属于豆科草本植物黄芪的干燥提取物，具有抗肿瘤、增强免疫、促进生长等功效。有研究表明黄芪甲苷能够抑制MMPs活性，延缓KOA的临床症状〔4〕。本文采用不同浓度的黄芪甲苷对骨关节炎(OA)退变软骨细胞进行干预，研究黄芪甲苷处理后对软骨细胞MMP-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 软骨细胞来自青海大学附属医院收集的10例早期KOA患者的软骨组织。试剂及仪器：黄芪甲苷(Solarbio)，胎牛血清(FBS，杭州沃森生物技术有限公司)，双抗、DEME(Gibco公司)，MTT(南京都莱生物技术有限公司)，CO2培养箱(德国IRM公司)，Annexin-FITC、Propidiuym Iodide(上海劢瑞生物科技有限公司)，二抗：辣根过氧化物酶标记IgG(上海研卉生物科技有限公司)，Triton-100细胞裂解液膜蛋白试剂盒(TIANGEN公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MMP-1 ELISA 试剂盒(R&D Systems公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将患者的软骨组织置于加入双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗3次，用无菌剪刀剪成1 mm3的组织块，放入培养皿中，加入含10% FBS的DEME培养液中，37℃ 5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长后更换新培养液，待细胞数目增殖至80%，除去上层的培养液，用PBS溶液清洗，加入0.25%胰酶溶液，室温消化5 min终止细胞生长，加入DEME培养液后将细胞吹打混匀，800 r/min离心5 min，收集细胞，按照1∶3比例进行传代培养。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测软骨组织细胞活性 取对数期的细胞接种于96孔细胞培养板中，加入100 μl 10%FBS的DEME培养液，实验分为五组，每三孔为一组，分别接入不同浓度黄芪甲苷进行处理：对照组加入DEME培养液；另外4组分别加入20、40、60、100 mmol/L的黄芪甲苷，均培养1 d。二氧化碳培养箱培育1 d，加入20 μl MTT,37℃反应4 h，800 r/min离心5 min，小心吸取上清，加入200 μl二甲基亚砜(DMSO),室温反应10 min，570 nm下进行OD值测定。按照公式：(OD样品-OD空白)/OD空白×100%计算细胞存活率。

1.2.3 MTT法检测软骨组织细胞的最佳培养时间 根据上述实验，选取最佳黄芪甲苷浓度进行培养，方法同上，分别培养12 h、1、2、3 d。采用MTT法测定其细胞存活率。

1.2.4 采用qRT-PCR法检测MMP-1 基因表达情况 按照黄芪甲苷作用细胞的最佳浓度及培养时间进行细胞的培养，对照组不加黄芪甲苷。反应结束后进行细胞膜RNA的提取，反转录为cDNA,设计MMP-1 基因qRT-PCR引物，上游：AGAGCAAGATGTGGAGATGG，下游：CTTGACAGGTCTGGTGTGTA，以甘油醛-3-磷酶脱氢酶(GAPDH)为内参，上游引物：TGATCCATTCATTGACCTCC;下游：GTTCACGCCCATCACAAACA，反应体系：SYBRTM Premix Ex TaqⅡ 10 μl，DEPC水8 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，各种不同处理的cDNA模板1 μl。在Bio-Red荧光定量PCR仪上按照反应程序：94℃ 3 min；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 20 s；40个循环进行反应，采用2-ΔΔCT算法进行基因表达的数据分析。

1.2.5 ELISA 法检测细胞上清液中 MMP-1的表达 将试剂盒中的标准样品(浓度：10 000 pg/ml) 稀释2、4、8、16、32倍，同时将MMPs抗体、过氧化物酶复合物稀释100倍，实验分为6组，对照组只加待测样品，实验组为不同梯度的标准品加100 μl的细胞上清液。37℃反应1.5 h，加入MMPs抗体稀释液100 μl，37℃反应1 h，反应结束后加入PBS溶液漂洗3次，加入100 μl ABC工作液，对照组不加，37℃反应30 min，PBS溶液漂洗3次，每孔加入显色液90 μl，黑暗条件下反应20 min，加入四甲基联苯胺(TMB)终止显色液，450 nm测定OD值。

1.2.6 检测黄芪甲苷处理后MMP-1的蛋白表达 对反应后的细胞进行细胞膜蛋白的提取，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，对照组不加黄芪甲苷处理。配制12.5%分离胶与5%浓缩胶，保证每孔蛋白上样量保持一致，Marker 2.5 μl，样品在浓缩胶时电压为80 V，进入分离胶后电压调至120 V，待反应结束后，将蛋白凝胶置于PBS中漂洗3次，每次10 min，在4℃过夜进行NC转膜，反应结束后在含5%脱脂牛奶的PBS中进行过夜封闭，加入 PBS稀释的一抗，4℃过夜，PBS洗涤3次，每次约10 min，加入PBS稀释后的二抗，4℃过夜，PBS清洗3次，采用荧光扫描仪进行扫描，保存实验结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1 MTT法检测不同浓度黄芪甲苷处理后细胞的存活率 与对照组〔(27.36±4.57)%〕相比，黄芪甲苷处理后关节炎软骨细胞存活率提高，在20～100 mmol/L浓度范围内与黄芪甲苷作用浓度呈剂量依赖，20 mmol/L存活率为(32.56±5.62)%，40 mmol/L为(40.52±5.38)%，60 mmol/L为(47.36±6.42)%，100 mmol/L效果最佳(62.43±6.48)%。

2.2 MTT法检测软骨组织细胞的最佳培养时间 随着培养时间的延长，细胞的存活率增加，在12 h～3 d内，第3天达到存活率最高〔(49.68±5.76)%〕，12 h为(27.69±4.23)%，1 d为(33.75±5.28)%，2 d为(42.71±4.68)%，对照组为(24.75±3.74)%，黄芪甲苷第3天对病变软骨细胞治疗效果最佳。

2.3 黄芪甲苷处理后细胞内MMP-1基因表达情况 与对照组相比，黄芪甲苷处理后的细胞中MMP-1基因表达量均下降，MMP-1基因的表达量随着黄芪甲苷的作用浓度与作用时间的增加而下降。100 mmol/L时，第2天时MMP-1基因表达量最低，第3天时有上升的趋势，有可能是黄芪甲苷的使用浓度过高导致。见表1。

2.4 ELISA 法检测细胞上清液中 MMP-1的表达 未进行处理的软骨组织中，正常软骨组织中MMP-1少量表达，关节炎软骨组织中MMP-1的浓度为正常组织中的2倍，处理后正常软骨组织中 MMP-1浓度并未发生变化，黄芪甲苷处理后的关节炎软骨组织中MMP-1浓度降低为处理前的0.5倍，但仍高于正常软骨组织中MMP-1的浓度。见表2。

表1 黄芪甲苷处理后细胞内MMP-1基因表达±s)

与对照组比较：1)P<0.01，2)P<0.05

表2 黄芪甲苷处理后细胞上清液中 MMP-1 浓度的变化

与对照组比较：1)P<0.01 ，与正常软骨组织组比较：2)P<0.05

2.5 Western印迹检测黄芪甲苷处理后MMP-1的蛋白表达 正常软骨组织中MMP-1少量表达，关节炎软骨组织中MMP-1蛋白大量表达，与对照组相比，黄芪甲苷处理后软骨组织中MMP-1蛋白表达量降低，但仍高于正常骨组织。见图1。

a：正常软骨组织；b：关节炎软骨组织；c：黄芪甲苷处理后的软骨组织图1 黄芪甲苷处理后MMP-1蛋白表达

3 讨 论

KOA主要表现为关节软骨改变、软骨组织受到损害、骨质增生，常见于老年人群中，发病时关节肿痛，甚至难以行走，目前还没有能够较好地治疗KOA的药物，经常用的药物为非甾体抗炎药(NSAIDS)。虽然NSAIDS治疗KOA起到很好的消炎作用，但是药物的副作用很大。近年来中药治疗KOA取得了较好的成就，如独活寄生汤、姜黄素等。黄芪甲苷具有降压、增强免疫、抑制骨组织磨损等功效〔5〕，汤晓晨等〔6〕研究表明黄芪甲苷能够抑制退变软骨细胞合成白细胞介素(IL)-1β，降低软骨细胞退变的速度。孟祥奇等〔7〕研究表明黄芪甲苷通过升高软骨细胞Ⅱ型胶原(ColⅡ)及ACAN的表达进而降低KOA关节软骨细胞衰变的速度。KOA主要是由于软骨细胞合成减少而凋亡过度，与正常细胞的凋亡不同，细胞凋亡加速会导致软骨组织和细胞的破坏〔8〕，丁辉等〔9〕研究表明在OA晚期沉默调节因子(SIRT)1表达量升高使软骨细胞凋亡率升高进而破坏骨组织。因此，抑制OA软骨组织细胞的过度凋亡，是延缓KOA加剧的一种方法。本研究结果表明黄芪甲苷处理后OA软骨组织细胞存活率提高，与黄芪甲苷作用浓度呈剂量依赖，并随着作用时间的延长而增加，表明黄芪甲苷能够通过抑制OA退变软骨细胞的死亡，延缓骨组织的破坏。MMPs参与机体正常生理活动如分娩、乳腺退化、伤口修复、骨组织吸收等〔10〕，MMPs升高会导致很多疾病的发生，如动脉粥样化、骨肉瘤等，在软骨组织局部MMPs表达量升高破坏细胞外基质的平衡状态,导致软骨逐渐出现糜烂、溃疡增生等一系列退行性变化〔11〕。研究发现MMPs在正常机体内表达量较低，当关节发生炎症或病变时，MMPs表达量迅速上升，并激活大量酶原降解细胞外基质，使骨组织发生损伤〔12〕。有研究表明，在KOA组织中，MMP-1高度表达，可能参与细胞基质ColⅡ型胶原降解，且表达量越高，软骨组织退变程度越严重〔13〕。本实验结果表明，正常软骨组织中MMP-1也表达，在KOA软骨组织中，MMP-1大量表达，黄芪甲苷作用后其表达量下降，并与作用时间和作用浓度呈负相关，而且黄芪甲苷治疗KOA与MMP-1蛋白下调相关。ELISA 原理主要是使酶标记的抗原抗体反应在固相表面检测特异性抗原或抗体。反应后待测物发生颜色变化，利用酶标仪测定待测物的量与底物的量相关〔14〕。ELISA 检测OA患者滑液中蛋白多糖(PG)的含量高于正常骨组织，透明质酸(HA)含量低于正常组；检测KOA患者和正常人血清IL-1和IL-6含量，KOA患者的IL-1和IL-6含量高于正常人，进而推测KOA患者的病情程度〔15〕。

综上所述，本研究结果表明黄芪甲苷能够抑制OA退变软骨组织细胞MMP-1的表达，进而抑制MMP类金属降解酶对软骨组织细胞外基质的破坏，从而降低骨组织的损伤，减缓OA。本文只是从细胞生物学的角度进行基础性研究，对于其分子机制有待进一步深入研究。

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〔2016-03-26修回〕

(编辑 袁左鸣)

国家自然科学基金(No.81473800)

1 北京中医药大学

孟庆刚(1964-)，男，博士，教授，主要从事中医基础研究。

刘建红(1972-)，女，硕士，副教授，主要从事中西医结合研究。

R394.2

A

1005-9202(2017)03-0532-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.005