水稻抗稻瘟病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用研究

徐华山　周雷　刘凯　李培德　游艾青

摘要 Pi35是具有广谱持久抗性的水稻抗稻瘟病基因，在水稻抗病育种中具有重要作用。通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到1个Pi35基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物研究结果表明，利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Pi35的基因型。该方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。

关键词 水稻；Pi35基因；特异SNP；共显性分子标记

中图分类号 S511；Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）21-0020-02

水稻是我国重要的粮食作物，稻瘟病是我国稻作区最严重的的病害之一，严重影响稻谷产量和质量。利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种成为解决问题的最佳途径。Pi35位于水稻1号染色体，供体亲本来源于日本粳稻品种Hokkai 188（Nguyen等，2006），携带Pi35基因的Hokkai 188（北海188）和Fukei 138（藤系138）是日本水稻育种的骨干抗源，抗叶瘟水平高且稳定，因此Pi35对于培育具有稻瘟抗性的水稻品种具有巨大的利用价值[1-2]。本研究在2对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第3位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻材料包括抗性品种Fukei 138（藤系138）；感病等位基因亲本材料9311；Fukei 138（藤系138）与9311杂交获得的F1代材料；生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号、R1128。

1.2 引物设计

本研究在2对交叉引物PCR（PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP）方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第3位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，如图1所示，通过设计4条引物（PF、PR、NF、NR）并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，引物详细信息见表1，根据扩增条带类型鉴定基因型。

1.3 PCR扩增

PCR反应体系为15 μL，含1.5 μL 10×Buffer，1.0 μL dNTPs（10 mmol/L），4条引物PF、PR、NF与NR各为0.1 μmol/L；Taq酶0.2 μL（5 U/μL），1.0 μL模板DNA（50 ng/μL），其余用ddH2O补齐；PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

2 结果与分析

2.1 序列比对及标记开发

对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，将获得序列首先与包含感病等位基因的材料日本晴及9311的对应序列进行比对，对于具有差异序列的位点再利用包含其余3个等位基因的材料进行测序比对确认，最终在Pi35基因3780T处获得1个Pi35特异性SNP位点，Pi35等位基因型为T碱基，其余基因型均为G碱基。因此，通过设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Pi35等位基因的鉴定。

引物设计原理如下（图1）：在设计T型等位基因鉴定引物时，根据PCR-CTPP方法原理，首先在该SNP位点上游设计正向引物PF（表1），以该SNP位点的T碱基的互补碱基A作为3′端在该位点设计反向引物PR，PR的3′端的A碱基与T型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成A/G错配无法扩增。同理，按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的NF与NR，试验结果表明，NF与NR在T型材料中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性在NF的倒数第3位引入了一个错配碱基A增强其特异性，结果表明该引物只有与G型等位基因材料扩增时有1条266 bp条带，与T型材料没有条带扩增；4条引物名称、序列及扩增片段长度如表1所示。

2.2 供试材料Pi35基因型鉴定

利用Pi35-PF、Pi35-PR、Pi35-NF、Pi35-NR鉴定Fukei 138（藤系138）、9311、Fukei 138（藤系138）与9311杂交获得的F1代材料、生产上常用骨干亲本材料培矮64S、广占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级巴斯玛蒂、盐稻4号及R1128。结果显示纯合Pi35基因型材料可以扩增出535 bp和317 bp 2条条带，杂合Pi35基因型材料扩增出535 bp、317 bp和266 bp 3条条带，不含Pi35基因的材料只有535 bp和266 bp 2条条带（图2）。对扩增产物测序的结果表明，该标记引物可以准确地鉴定水稻材料中的Pi35基因型。

3 结论与讨论

利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种是解决水稻稻瘟病抗性问题的最佳途径。紧密连锁的分子标记存在交换的可能，不能完全准确地鉴定水稻材料中的抗性基因，因此开发适合分子育种需要，能够高通量、低成本检测抗病基因的基因内功能标记成为当务之急。马 建等[3]开发的Pi35-dCAPS标记能够准确鉴定水稻材料中是否含有Pi35基因，但是需要对水稻材料DNA扩增后进行酶切才能判定目标基因型。本研究开发的Pi35基因内特异性共显性SNP分子标记可以直接通过鉴定PCR产物判定目标材料的基因型，无需酶切，检测准确率100%，不仅可以判断目标材料是否含有Pi35基因，还可以检测出目标材料的基因型是杂合还是纯合[4-6]。该标记具有高通量、低成本的优点，适合分子育种材料的大批量检测，为水稻抗稻瘟病育种提供了便利。

4 参考文献

[1] 雷财林，凌忠专，王久林.水稻抗病育种研究进展[J].生物学通报，2004（39）：4-7.

[2] FUKUOKA S，YAMAMOTO S，MIZOBUCHI R，et al.Multiple functional polymorphisms in a single disease resistance gene in rice enhance durable resistance to blast[J].Sci Rep，2014，4：4550.

[3] 马建，马小定，赵志超，等.水稻抗稻瘟病基因Pi35功能性分子标记的开发及应用[J].作物学报，2015，41（12）：1779-1790.

[4] 易怒安，李魏，戴良英.水稻抗稻瘟病基因的克隆及其分子育种研究进展[J].分子植物育种，2015，13（7）：1653-1659.

[5] 邢鹏，张幸，李冬梅.稻瘟病抗性基因在主要育种亲本中的分步研究[J].分子植物育种，2015，13（3）：505-512.

[6] 李江，黃东益.水稻抗稻瘟病分子育种研究进展[J].安徽农业科学，2007，35（35）：11413-11415.