果树细胞悬浮培养研究进展

李海英++邵静++张学明++郑亚杰

摘 要：植物细胞悬浮培养是一种新型的培养技术，在育种、生产次生代谢产物和生物工程中，具有广泛的应用。本文主要分析了植物细胞悬浮培养主要影响因素，并综述了果树方面的研究概况，讨论了今后发展前景。

关键词：果树；悬浮细胞；培养；研究进展

中图分类号：Q31 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20170133039

1 果树细胞悬浮培养研究概况

植物细胞悬浮培养最初用于草本植物，直到20世纪90年代初，学界才在木本植物中应用的研究报道。例如，利用悬浮培养中国小叶杨，成功获得了悬浮细胞系并得到再生植株。

1.1 悬浮培养体系建立方面

自1954年Muir等第1次进行植物细胞悬浮培养以来，国内外在此方面已经取得了很大进展。Dheda等成功地由煮食蕉 Bluggoe（ Musa spp. ABB）建立起胚性细胞悬浮系，并通过体胚发生途径获得再生植株。张进仁等以锦橙试管苗下胚轴切段诱导愈伤组织，首次用细胞悬浮培养方法获得柑桔植株。陈崇顺对杏细胞悬浮培养进行了研究，结果表明，选用未木质化的外植体，提高培养基中Ca（N03）2 、2，4-D和激动素的浓度，增加继代培养次数，能快速得到100% 的脆散型愈伤组织，成功地建立其细胞悬浮培养系统。周玉萍等以基因型不同的香蕉、大蕉和粉蕉吸芽茎尖培养产生的分生芽为外植体，不经过愈伤组织阶段直接由茎尖分生细胞，得到许多成分单一、分裂能力强大的胚性细胞悬浮系。BLANDO 等和INFANTE利用悬浮细胞培养技术，来培养森林草莓叶片愈伤组织，首次获得了再生植株。

1.2 果树育种方面

目前，植物细胞悬浮培养育种方式，已经在国内外得到推广和应用。鲍雷珍、李佩芬等以葡萄花丝为材料悬浮培养后，用秋水仙素进行诱变处理获得了变异体（同质变异体）植株。徐春香等采用农杆菌介导法，将香蕉抗冻蛋白AFP基因，转入胚型悬浮细胞系中，成功获得转基因植株。

1.3 次生代谢物培养方面

悬浮体系在植物次生代谢物规模化培养中应用非常多，但在果树方面的应用还较少。龙小凤等以巨峰葡萄果皮作为外植体，通过研究，发现暗培养下的愈伤组织更适合悬浮培养，利用这种培养方式，白藜芦醇产量可达3.38 mg/L。曲均革等利用葡萄细胞悬浮培养生产次生代谢物花青素的研究取得了一些进展，认为接种量为1.60g 时，经过7d 继代周期培养条件下花青素合成相对稳定。

2 果树细胞悬浮培养过程中的主要影响因素

2.1 愈伤组织的状态

愈伤组织状态如何，对细胞悬浮系的稳定情况具有重要影响。愈伤组织可分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织。研究表明，只有胚性愈伤组织能成功建立胚性细胞悬浮系。张进仁等对幼嫩新鲜愈伤组织进行继代培养，结果发现该愈伤组织生长快、繁殖系数高，能够较好地用于建立悬浮培养细胞系。

2.2 细胞悬浮培养初始密度

细胞在进行分裂和生长的时候，需要其内源代谢物质达到一定的阀值，只有在细胞初始密度与营养物比例合理，培养效果才能达到理想状态。周春江等对草莓悬浮细胞培养的研究表明，体积为40mL的悬浮细胞培养液，以4～6 mL接种量为宜。程江华在150mL三角瓶中加入25mL培养基，当接种量为3g鲜重时，石榴细胞增殖速度快，增值倍数可达2.83倍，且细胞生长状态、分散性都比较好，但当接种量小于2g/25mL时，细胞生长速度就会趋缓，而在大于4g/25mL时，不仅细胞生长速度减缓，还会出现褐化現象。

2.3 摇床转速

由于植物细胞体积大，细胞壁主要由纤维素组成，液泡占到95 % 以上，对剪切力比较敏感，因而必须要控制好摇床的转速，一般控制在90～120r/min内为宜 。但涂艺声等认为草珊瑚的悬浮培养物最佳的摇床转速为40r/min，在100r/min 速度下振荡培养几乎难以存活。

2.4 激素浓度

在细胞悬浮培养过程中，激素是调控细胞状态的重要因素。倪建伟等以野生唐古特白刺为外植体进行研究，发现激素2，4-D是影响愈伤组织相对生长量和形态的主要影响因子。王巍巍等在沙枣细胞悬浮培养试验中，发现激素组合对沙枣细胞生长影响很大，尤其是附加 BA 0.1mg/L和 TDZ 0.1mg/L组合的NT液体培养基，细胞增长系数达到5.73。陈崇顺等通过对诱导杏的茎段愈伤组织进行研究，发现2，4-D是组织形成、生长必需的。不过，杏的品种不同，对2，4-D的浓度敏感性也存在差异。魏岳荣等以贡蕉 （AA）未成熟雄花序为外植体，建立胚性细胞悬浮系，结果表明，9μmol /L 2，4-D对外植体愈伤组织的诱导效果最佳，诱导率为40.96% ，胚性愈伤组织诱导率可达7.45 %。

2.5 蔗糖浓度

蔗糖是植物赖以生长的重要碳源，也是渗透压调节剂，对植物具有重要作用。张洁在草莓悬浮培养中发现，在 0～30g/L 时，细胞增殖倍数随着蔗糖浓度增加而上升，30g/L时细胞的增殖倍数达到最大，而超过60g/L的时候，细胞增殖倍数就会显著降低。杜晓映认为，合适的蔗糖浓度为30g/L。

2.6 有机附加物

木本植物组织和细胞培养以无机氮为主，有时辅以有机氮源，氨基酸是常用的有机氮源之一。在禾本科植物胚性细胞悬浮系的建立中，已对椰乳、酵母提取物、水解酪蛋白等的作用进行了研究，多数结果表明，有机添加物能促进胚性细胞悬浮培养物的增殖、生长，提高其胚胎发生能力。在M1培养基中加入酪蛋白和脯氨酸，将有利于胚性愈伤组织的诱导。

2.7 继代周期

继代周期的长短和换液比例，会影响悬浮细胞的生长状态。如果继代周期短，将会降低细胞生长速度，反之，则会因细胞液泡变大，而导致悬浮细胞极度“饥饿”。陈崇顺等根据杏细胞悬浮培养结果，认为增加继代培养次数，将会有效提高愈伤组织的脆散性，达到5次时，具有高脆散性愈伤组织的比例可达90% 以上。

3 发展前景

根据植物细胞悬浮系自身的特点，可以用于生产次生代谢物，此类研究在中药方面比较普遍，在果树方面的报道还很少，具有很大开发潜力。此外，可以广泛应用到果树育种中：直接用于原生质体分离、培养与杂交。根据已有报道，将愈伤组织悬浮细胞系或胚性悬浮系作为分离原生质体的起始材料，原生质体的产量和活力都比较高，培养也更容易。而原生质体能克服性细胞不亲和障碍，实现远缘的体细胞杂交；用于基因转移。通过引入外源基因，增强植物抗病毒、抗虫、抗逆、抗除草剂、改良果实品质等能力；筛选突变体。用诱变剂直接处理悬浮培养的单细胞和原生质体，筛选所需要的突变体，是直接获得同质突变体的最理想方法。细胞悬浮培养技术对果树品种改良，具有关键作用，发展前景比较广阔，如何在实践中，成功应用此项技术，是我国育种工作者在今后的育种研究中重点探索的内容之一。

参考文献

[1]李阳生.水稻体细胞无性系变异全国首届青年农学会学术年会论文集[C].北京：中国科学技术出版社，1992：113-118.

[2]孙敬三.植物细胞工程实验技术[M].北京：科学出版社，1995.

[3]谢华永.杨树胚性悬浮细胞系建立与原生质体融合研究[D].南京林业大学硕士学位论文，2004.

作者简介：郑亚杰（1960-），女，辽宁省开原市，本科，研究员，果树遗传育种与栽培技术。