酶抑制—比色法检测聊城市果蔬有机磷和氨基甲酸酯农药残留

曾庆华++宋伟华++樊琛++孙小凡

摘要：参照GB/T5009 199-2003，采用酶抑制-比色法进行检测，分析山东省聊城市水果、蔬菜的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留状况。结果表明，有机磷和氨基甲酸酯农药残留以水果类为最多，其次是根茎类和果菜类，叶菜最少；在蔬菜中农药残留较多的是萝卜、蒜薹，较少的3种是菜花、辣椒、白菜；水果中农药残留较多的为柑橘，较少的为山楂；未检测出农药残留超标样品，证明果蔬安全状况已经大为改善。酶抑制-比色法存在一定的误差，还需提高酶源稳定性和灵敏性，改进样品提取工艺。

关键词：农药殘留；有机磷；氨基甲酸酯；果蔬；酶抑制-比色法；山东省聊城

中图分类号：O656.31；S481+.8 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5634-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.051

Detection on Organophosphorus and Carbamate Pesticide Residues of Fruits and Vegetables with Enzyme Inhibition-colorimetry

ZENG Qing-hua， SONG Wei-hua， FAN Chen， SUN Xiao-fan

（Department of Food Science and Engineering， Liaocheng Univercity， Liaocheng 252059， Shandong， China）

Abstract： The GB5009/199-2003 was used as testing standard， the enzyme inhibition-colorimetric method was adopted to detect and analyze the organophosphorus and carbamate pesticide residues of fruits and vegetables in Liaocheng of Shandong province. The results showed that， there were the most organophosphorus and carbamate pesticide residues in the fruit category， followed by the root and fruit vegetables， while the least of which was the leaf vegetables. The maximum pesticide residues were found in radish and garlic， while the minimum were in cauliflower， pepper and cabbage in the vegetable category. The maximum pesticide residue was found in citrus， while the minimum was in hawthorn in the fruit category. No excessive residual sample was detected， which indicated that the security situation had been significantly improved in fruits and vegetables. There were a certain errors in enzyme inhibition-colorimetry， greater efforts should be made to improve the stability and sensitivity of the enzyme source， and the sample extraction process.

Key words： pesticide residues； fruits； vegetables； enzyme inhibition-colorimetry

农药是重要的农业生产资料，在为人类带来经济利益的同时，也对人类健康和环境安全造成一定的威胁。中国是农业大国，粮食、蔬菜和水果种植面积大、品种多，不合理使用农药导致农药残留超标相当严重[1，2]。全国蔬菜每年使用杀虫剂达到8.25万t以上[3]，农药残留超标现象普遍存在[4-12]，常用的高毒杀虫剂以有机磷和氨基甲酸酯类为主[13]，对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的检测在实践中尤为重要。

农药残留的检测方法较多，各有利弊。气相色谱法精确度和灵敏度高，但检测成本高，不适合快速检测，不能检测热稳定性差的农药；液相色谱法可以用于分析热稳定性差的液体化合物，也可以分析高沸点、难挥发化合物，但检测成本高，测定时间长；薄层色谱法操作难度较大；免疫法检测（酶联免疫法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法等）检测精确度高、耗时短，但需要使用抗体试剂，价格昂贵，不适宜大批量样品的筛选检测。常见的农药残留快速检测方法还有酶抑制法、生物传感器法、活体检测法、免疫分析法和化学法-速测灵法[14]等，其中酶抑制法操作简单、检测速度快，已成为蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药快速检测的国标方法[15]。市面上的胆碱酯酶主要是乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶[16]，本研究采用乙酰胆碱酯酶酶抑制-比色法检测果蔬农残。

同一种酶因来源不同，提取、保存方法不同，检测灵敏度也不同[17，18]；酶源不同，其最适反应温度、pH及反应时间也会有所差别[19-21]。对酶抑制比色检测法来说，酶反应初始阶段吸光度上升快，基本呈线性增加，农药残留的浓度对吸光度作用效果明显，宜采用反应开始3～5 min吸光度的变化值来计算抑制率[22]；而胆碱酯酶在20～40 ℃时活性较强，灵敏度高；溶液pH为7.0～8.0是最佳测试条件。因此，本研究酶反应条件设为温度20～30 ℃、反应时间3 min、溶液pH 8.0。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果蔬共30个批次，398个样品，取样时间为2014年11月。蔬菜包括叶（花）菜类、鳞（根）茎类、甘蓝类、果菜类和豆类，水果包括浆果类、核果类、柑橘类等。大部分样品是从亚太农都交易市场随机抽取，少量由个体户、家庭农场或政府部门送检。

检测所用试剂购自深圳市安鑫宝科技发展有限公司。试剂配制方法和保存条件如下：

缓冲溶液，1包磷酸缓冲剂加1 000 mL去离子水，搅拌溶解，制成pH 8.0缓冲溶液，室温保存。显色剂，1瓶显色剂加25 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。底物，1瓶底物加入10 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。乙酰胆碱酯酶，1瓶酶液加18 mL缓冲溶液，4 ℃冰箱保存。

1.2 仪器与设备

SPR-88C型高速大容量农残检测仪，深圳市安鑫宝科技发展有限公司；HY-5型回旋式振荡器，金坛市科兴仪器厂；JY/YP2002型电子天平，精确度0.01 g，上海上天精密仪器有限公司；KQ-100B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；微量移液器，规格0～5 mL、20～200 μL、5～50 μL；定性滤纸、烧杯、秒表、温度计、湿度计等。

1.3 试验方法

1.3.1 试验步骤 试验步骤如下：待检样品处理→检测板加样→抑制反应→显色反应→检测→结果判定→复检。

1.3.2 检测方法 参照文献[23]进行。

1）样品的提取。对于体积较大的水果、果实类蔬菜，去掉表面泥土，用削皮器取皮，剪成1 cm2左右的小块，称取2 g放入烧杯中，加入10.00 mL缓冲液，振荡器振荡提取2 min，过滤取滤液，静置3～5 min待用。对于蒜、山楂、枣、葡萄等较小的样品采用整颗浸泡的方法，对于葱、韭菜等容易出现假阳性的样品用分段提取的方法。

2）样品的检测。用微量移液器在安鑫宝专用的检测板的A1、A2、A3、A4 4个孔位分别加入150 μL缓冲溶液为空白对照，其余孔位分别用移液器加入150 μL的样品提取液。各孔位均加入50 μL酶液、50 μL显色剂。检测板放入通道内设置振板速度为中速，振动10 s，静止10 min，加入20 μL底物，迅速放到通道内振动10 s，点击开始检测，仪器便开始自动检测，3 min后仪器显示吸光度变化和抑制率等结果。

1.4 结果判断

以吸光度变化或抑制率判断结果。样品提取液对酶的抑制率在40%～50%之间时为弱阳性，样品提取液抑制率大于50%时为阳性，小于40%为阴性。对于阳性结果的样品需要重复检验2次以上。

抑制率=×100%；式中，ΔA0为对照溶液反应3 min吸光度变化值；ΔAt為样品溶液反应 3 min吸光度变化值。

2 结果与分析

2.1 空白组对果蔬农药残留影响试验

2.1.1 同一空白对照组样品吸光度与抑制率的关系 对外部送检的22份样品分两批次进行检测，选择同一空白对照组的部分原始检测结果进行分析，见表1和图1。有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，其抑制率与农药浓度呈正相关。即在一定条件下，样品农药残留浓度越高，其吸光度变化值越小，抑制率越大。

2.1.2 不同空白对照组对样品检测结果的影响 以所抽检的娃娃菜为研究对象进行平行与对照检测[24]，选择符合要求的空白对照组进行数据分析（图2），1-3孔位为同一空白对照组，4-6为同一空白对照组。可见，样品平行测定结果在误差允许范围之内，抑制率变化幅度较吸光度变化值大。在不同批次不同样品农残比较时，用吸光度变化值判断要比抑制率更准确。

2.2 果蔬样品农药残留检测

统计30个批次398个样品的农药残留情况，未检出农药超标样品。对检测数据进行分析（表2）并比较农药残留（图3）。样品种类中，农药残留为叶菜类<果菜类<根茎类<水果类；在蔬菜中，农药残留为萝卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黄瓜>胡萝卜>娃娃菜>西红柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜；水果农药残留为柑橘>苹果>梨>山楂。萝卜、蒜薹、芫荽农药残留检测结果偏高，可能是其次生物质干扰所致。

3 小结与讨论

3.1 结论

样品农药残留为叶菜类<果菜类<根茎类<水果类，在蔬菜中农药残留为萝卜>蒜薹>芫荽>菠菜>芹菜>黄瓜>胡萝卜>娃娃菜>西红柿>扁豆>菜花>辣椒>白菜，水果中农药残留为柑橘>苹果>梨>山楂。并未检出农药残留超标样品。

3.2 注意事项

酶抑制-比色法进行农药残残留检测，需要注意一些问题，控制不确定因素的影响[25]。

3.2.1 胆碱酯酶的影响 ①为确保酶的活性，酶试剂及底物要在低温条件下保存。②检测前需将试剂从冰箱取出，恢复至室温后再进行检测，避免因低温影响酶的活性。③如环境温度变化较大，检测时间对结果影响较大，需重新进行对照测量。④加入的各种试剂量必须准确，多加或少加都会影响检测结果。⑤加入底物时动作要迅速，否则检测时间出现偏差，影响数据准确性。

3.2.2 样品处理的影响 样品含有大量色素，如紫甘蓝、胡萝卜；或大量汁液，如山药、柠檬；或丰富的胶质和纤维素，若处理不当，会干扰显色，影响检测结果。制样时，样品表面泥土较多应擦去而不能用水冲洗。取样要具有代表性，叶菜最好选取不同植株叶片的叶尖部分，样品不能太碎，以免色素释放。削皮取样要防止将汁水带入。除此之外，要严格控制提取时间，时间过短不能充分提取，过长会将色素浸出。样品混浊时使用定性滤纸过滤或者延长静置时间。部分果蔬如葱、姜、蒜、韭菜、辣椒、胡萝卜、芹菜、芫荽、茭白、蘑菇中含有酶抑制物质，与农药作用效果相似，应针对不同情况采取措施[26]。

3.3.3 操作者的影响 检测过程主要是微量试剂间进行反应，注意移液枪的使用，吸取液体之前要进行润洗。试验中配液用水均为一级纯净水，不可用桶装纯净水代替，容器使用前要严格按照自来水冲洗→超声波清洗→自来水荡洗→纯净水冲洗2～3遍→倒置晾干步骤进行清洗，防止残留污染待检测液。

3.2.4 酶抑制法检测农药种类有限 酶抑制法只能检测蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留，对某些硫代磷酸酯类农药（如伏杀硫磷）和菊酯类农药灵敏度不高，只能用于蔬菜的初筛。后续需对农药超标量进行定性定量分析，方能作出结论。

3.3 展望

酶抑制法快速检测农药残留技术减少了工作量，提高了分析效率，保证流通蔬菜的安全性。酶试剂对快检仪的检测结果有直接影响，在应用农残快检仪进行快速筛查检测时，对同一批样品最好使用同一批次、同一来源的酶试剂，以避免酶差异对结果的影响。植物的某些成分会对酶反应产生干扰，影响结果的准确度。因此在提高酶源稳定性和灵敏性，改进样品提取工艺等方面，还需进一步研究探讨，使快速农药残留检测技术更便捷、更准确。

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