基于系统药理学方法研究头痛宁胶囊治疗偏头痛的TNF机制

聂西周+杜霞+张瑞瑞+何娟+苏瑞+马虎强+穆珺+李晔+刘峰

[摘要]头痛宁胶囊是一种临床上治疗偏头痛的中药制剂，疗效确切。该研究采用系统药理学方法对头痛宁胶囊治疗偏头痛的药效成分及TNF机制进行了系统的研究。首先，从数据库中收集头痛宁胶囊单味药材所含化学成分，首次采用ADME性质预测初筛头痛宁胶囊的活性成分，然后利用CSDT模型进行靶标的搜寻和识别，并通过TTD等常见数据库将靶点映射在偏头痛疾病上来确定作用靶标。通过DAVID在线分析工具对靶标进行KEGG通路分析获得与TNF机制相关的靶标。最后，采用Cytoscape软件构建“药材-成分-靶标”之间的网络关系图，通过度值和介数中心度的分析，确定TNF通路中的关键药效成分及靶标，并对该作用机制进行初步探讨。结果表明，头痛宁胶囊中19个化合物与8个靶标在治疗偏头痛的TNF通路中起着至关重要的作用。该研究为头痛宁胶囊药效物质基础及作用机制研究提供了一种新的研究策略，为该制剂药效标志物的确定及临床研究提供了必要的理论依据。

[关键词]偏头痛； 头痛宁胶囊； 系统药理学； 肿瘤坏死因子信号通路

[Abstract]Toutongning capsule （TTNC） is a traditional Chinese medicine（TCM） with good effect for treating migraine in clinical application. In this paper， a systems pharmacology method was carried out to study the TNF mechanism of the TTNC on the migraine. First， the ingredients for TTNC were collected from TCM databases， and ADME properties prediction was firstly applied to screen out the active compounds of TTNC. Then， the target searching and identification was performed by using CSDT model， and the targets were mapped to the migraine disease to determine the active targets through some common databases like TTD. To obtain the targets related with TNF signaling pathway， KEGG pathway analysis was performed by DAVID online analysis tool. Finally， the "herbs-compounds-targets" network was built by Cytoscape software. According to the results of degree and betweenness in the network， the key active compounds and targets were determined to explore the TNF mechanism for TTNC. Results showed that 19 active compounds and 8 targets played a crucial role in the treatment of migraine by TNF pathway for TTNC. This work provided a new perspective to deepen the understanding of the TNF signaling pathway mechanism in migraine treatment by TTNC， and may provide a necessary theoretical basis for the determination of effective markers and the clinical research of this medicine.

[Key words]migraine； Toutongning capsule； systems pharmacology； TNF signaling pathway

偏頭痛（migraine）是一种常见的慢性和阵发性神经系统疾病，有单侧或双侧、搏动性发生的特点，常伴有恶心、呕吐、畏声、畏光等症状。流行病学调查结果显示，全球每年有2.4亿人发作偏头痛，造成的年直接经济费用高达580亿，是困扰人类健康的常见疾病之一^[1]。近年来，虽然国内外已有很多针对偏头痛的诊断指南并对其防治起到了一定的作用，诸如普奈洛尔和美托洛尔等化药被认为是临床上的一线用药。但事实上偏头痛的预防用药情况并不如预想的那么乐观，其服药周期长常常会带来诸多不良反应，诸如嗜睡、疲倦乏力、焦虑抑郁、肌肉酸痛、溢乳等副作用，都影响或限制了其应用。

中医学对偏头痛的认识早在《内经》中就有记载，有“首风”、“脑风”之称。现代医学认为，偏头痛的发病机制有神经学说和血管源学说，同时，TNF通路也备受关注，偏头痛患者TNF明显偏高，认为是其发病及其治疗的一条重要通路^[2]。研究表明，中药防治偏头痛不良反应相对较少，有较好的应用前景^[3-4]。头痛宁胶囊是由陕西步长制药研发生产的中药复方制剂，由土茯苓、天麻、制何首乌、当归、防风、全蝎6味药材加工而成，具有熄风涤痰、逐瘀止痛之功效，临床主要用于偏头痛的治疗，且疗效显著，未出现明显的不良反应和药物依赖性^[5-7]。目前，大多的研究集中在通过临床疗效探讨其治疗偏头痛的作用机制，对其药效物质基础和分子作用机制的研究尚不明确。因此，从分子水平识别药效成分和作用靶点，对于阐述整个复方的作用机制具有重要的意义。

系统药理学是从分子、细胞到组织、器官等不同水平上建立药物对于机体的作用，从微观到宏观的各个水平间相互关联的新方法^[8]。该方法的出现为中药复方的研究带来了新的研究思路。目前，该方法已经成功运用于中医药基础理论“君臣佐使”和“相须”的解析、对中药及其复方的作用机制的研究、经方验方的优化及新药研发等方面^[9]。本研究基于系统药理学方法，利用ADME性质筛选、靶标的识别、KEGG通路分析及网络的构建和拓扑性质分析等手段，对头痛宁胶囊治疗偏头痛的药效成分及作用机制进行系统地探究，为临床研究提供必要的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 头痛宁胶囊中药材成分收集 头痛宁胶囊是由土茯苓、天麻、制何首乌、当归、防风和全蝎6味中药组成的复方制剂。依托西北农林科技大学生命科学院创建的中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中国科学院上海有机化学研究所建立的化学专业数据库、中国台湾中医药大学建立的TCM Database@Taiwan数据库及美国国家医学图书馆提供的PubMed数据库及文献挖掘，对头痛宁胶囊中药材的化学成分进行了汇总，并建立头痛宁胶囊化学成分数据库。

1.2 ADME筛选 近年来，随着计算化学和统计力学的快速发展，根据实验中获得的大量ADME数据建立合理的计算机预测模型，用于高通量的虚拟筛选，从而对化合物进行“早期评价、早期淘汰”已经成为新药研发的重要策略之一。本研究将ADME性质预测引入到对头痛宁胶囊药效成分的初筛中，采用王永华等^[10]建立的Obioavail 1.1，preCaco2和基于最小二乘判别法的BBB预测模型对所有成分的OB（口服利用度），Caco-2，BBB（血脑屏障透过性）进行计算并初筛药效成分，阈值设定采用文献报道的OB≥30%，Caco-2≥-0.40和BBB≥-0.30^[8-9]。

1.3 靶标识别 本研究采用了一种基于随机森林（random forests，RF）和支持向量机（support vector machine，SVM）算法的CSDT（cross-species drug-target）模型进行靶点的搜寻和识别工作。该模型的训练集包括Drugbank数据库中6 511个药物分子和近4 000个与已知药物分子作用的蛋白质，且结果显示该模型的预测性能和谐性达到82.83%，敏感性为81.33%，特异性为93.62%，模型可靠。然后，借鉴UniProt（Universal Protein，UniProt）在线资源获得所有靶点对应的基因信息。通过查找TTD数据库（Therapeutic Target Database，TTD）、CTD数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB）将靶点映射于相应的疾病上，即可进一步获得头痛宁胶囊治疗偏头痛疾病的药效成分及其对应的靶标和基因信息。

1.4 KEGG信号通路分析 DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）是一种可以直观观测到基因的富集通路、目标基因对应的蛋白及其相互关系的在线分析工具。本研究采用DAVID对头痛宁胶囊作用靶标进行KEGG分析，从而确定TNF通路相关的药效化合物及靶标，以便进行网络的构建和分析。

1.5 网络的构建和分析 采用Cytoscape 3.4软件构建药材-成分-靶标的相互作用网络，其中，药材、成分和靶标用节点（node）表示，节点之间的相互作用用边（edge）表示。然后，利用Cytoscape软件中的NetworkAalyzer插件分析网络拓扑性质：度（degree）和介数中心度（betweenness），度和介数中心度越高，该化合物或靶标在网络中越重要，是网络的关键枢纽，在治疗疾病中发挥着关键的作用。

2 结果和讨论

2.1 头痛宁胶囊化学成分数据库 头痛宁胶囊全方中含动物药全蝎，现代药理学研究表明^[11]，全蝎主要活性成分为蝎毒素，是一种活性多肽，由20～70个氨基酸组成，具有镇痛的药理活性，有关蝎毒素镇痛机制的研究已有报道^[12]。然而，对于方中5味植物药，未见具体成分的机制报道。本研究采用数据库及文献搜集确定了5种植物药中所含的410种化学成分。其中，当归含125种，土茯苓含74种，防风含173种，天麻含16种，制何首乌含22种。这些化合物中，胡萝卜苷、β-谷甾醇和棕榈酸等5种化合物既存在于当归，也存在于土茯苓，白藜芦醇和棕榈酸等5种成分共同存在于土茯苓和制何首乌，当归和防风的共有易挥发性成分5种。这些化学成分多為黄酮、有机酸和酯类，据文献报道^[13-15]，黄酮类成分确有镇痛、调节心血管系统和抗炎调节免疫的药理作用，有机酸和酯类成分在抗血小板凝集、抗炎、止痛、抗氧化等方面的药理活性也已经得到证实。

2.2 ADME筛选 采用王永华等^[10]建立的ADME筛选模型获得上述410种化合物的OB，Caco-2和BBB值，通过筛选获得159个ADME性质较好的化合物用于后续研究。这些化合物大多为酚酸酯类和黄酮类化合物，例如：藁本内酯（MOL002201，OB=51.30%，Caco-2=1.30，BBB=1.24）、香草醛（MOL000635，OB=52.00%，Caco-2=0.68，BBB=0.41）、香草酸（MOL000114，OB=35.47%，Caco-2=0.43，BBB=0.09）、川白芷内酯（MOL011732，OB=59.65%，Caco-2=0.56，BBB=-0.02）、紫花前胡素（MOL013077，OB=39.27%，Caco-2=0.77，BBB=0.25）、人参炔醇（MOL001949，OB=42.44%，Caco-2=1.52，BBB=1.03）和珊瑚菜素（MOL011749，OB=43.39%，Caco-2=0.90，BBB=0.43）；黄酮类成分如：汉黄芩素（MOL000173，OB=30.68%，Caco-2=0.79，BBB=0.04）。这些化合物中部分化合物已被证明在治疗中枢神经系统性疾病有较好的药理学活性。例如：当归中的藁本内酯具有镇痛、抗炎、舒张血管的药理作用^[16-17]，防风中的人参炔醇既对缺血性损伤细胞具有保护作用，也对神经具有营养和保护作用^[18]。除此之外，白藜芦醇（MOL012744，OB=19.07%，Caco-2=0.80，BBB=-0.01）、云杉新苷（MOL000105，OB=21.44%，Caco-2=-0.90，BBB=-1.81）、落新妇苷（MOL004575，OB=36.46%，Caco-2=-1.29，BBB=-1.85）、新落新妇苷（MOL013118，OB=40.54%，Caco-2=-1.07，BBB=-1.57）、花旗松素（MOL004576，OB=57.84%，Caco-2=-0.23，BBB=-0.80）和天麻素（MOL007986，OB=8.19%，Caco-2=-1.33，BBB=-2.29）的ADME性质较低，但这些化合物已被证明在镇痛、心血管神经系统具有较好的药理活性。天麻素具有明显的镇痛、镇静、抗衰老等药理活性^[19]，落新妇苷、新落新妇苷在心血管神经系统的药理作用明显^[20]，而云杉新苷、花旗松素和白藜芦醇在中枢神经系统的镇痛抗炎作用也具有较为明显药理学特征^[20-22]。因此，最终确定165个化合物作为潜在的药效成分用于后续的研究。

2.3 靶标的识别 采用CSDT模型进行靶标的识别，并将所有靶点映射到疾病基因数据库中，对潜在药效成分和靶点、基因进行二次筛选，最终获得120个化合物和与之对应的482个靶标（去重后得45个靶点）。

2.4 KEGG信号通路分析 图1为头痛宁胶囊的所有靶标的KEGG通路分析结果。从图中可以看出，头痛宁胶囊治疗偏头痛的通路主要有钙信号、NF-κB，cAMP以及TNF等16种通路，其中，与TNF通路相关联的靶标有8个，与之对应的药效化合物高达106个，且与5种药材均有关联，是所有通路中与疾病相关的药效成分及靶标数最多的通路之一，因此，该通路可能为头痛宁胶囊治疗偏头痛的重要通路之一。

2.5 网络构建及TNF通路分析 图2为与TNF通路相关的药材、药材的药效成分和与之对应的8个靶标相连构建H-C-T网络关系图。网络中包含103个节点（含5个药材、106个化合物和8个靶标）和252条边。图中，绿色圆形节点代表药材，紫色三角形节点代表药效化合物，蓝色圆角矩形节点代表药物靶标，每条边代表不同节点之间的相互作用关系。采用网络分析获得网络关系的拓扑性质——度（degree）和介数中心度（betweenness），根据度值和介数中心度值判断头痛宁胶囊通过TNF通路治疗偏头痛的关键成分和靶标。最终，获得19个在TNF通路中起重要作用的化合物和8个靶标，见表1，2。其中，白藜芦醇（resveratrol，degree=16，betweenness=0.083 5）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=12，betweenness=0.004 9）、香草醛（vanillin，degree=10，betweenness=0.014 7）和汉黄芩素（wogonin，degree=10，betweenness=0.034 5）表现出较高的度和介数中心度值，这些成分在治疗偏头痛的TNF通路中至关重要。例如：白藜芦醇可显著抑制TNFR1的表达，进而抑制TNF-α刺激引起的炎症因子的释放，减轻内皮炎症^[23]，而汉黄芩素具有调节机体免疫作用的活性，能够抑制 NF-κB转录因子对TRAIL 诱导的凋亡的作用^[24]。

偏头痛是一种神经血管疾病，TNF通路是偏头痛发病机制的重要通路，图3为TNF作用通路图，图中红色代表与头痛宁胶囊相关的8个靶标。这8个靶标中前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，degree=101，betweenness=0.793 5）表现出特别高的度和介数中心度值，是TNF通路中的关键靶标，PTGS2基因是前列腺素的生物合成的核心酶，脑血管收缩是偏头痛前驱期的特征，而头痛发作时脑血管扩张呈特征性变化，PTGS2则是被认为的偏头痛的致痛因子之一^[25]。另据黄银兰等^[26]报道利用本经取穴可调控PTGS2基因表达从而治疗偏头痛，这也说明PTGS2与偏头痛有着密切的联系，但是目前尚无文献报道PTGS2治疗偏头痛的作用机制。此外，转录因子p65（RELA，degree=6，betweenness=0.021 3）、转录因子AP-1（JUN，degree=8，betweenness=0.004 3）和肿瘤坏死因子（TNF，degree=4，betweenness=0.007 1）也是该通路的主要靶标，与偏头痛的作用机制密切相关。ICAM1，IL6这2种基因在偏头痛的病变过程中可起到的诱导作用^[27]，两者存在相互关系并参与偏头痛机制的发生，而NF-κB在偏头痛的发病机制中，可增加FOS表达的作用，从而参与偏头痛的发生^[28]。MMP9则是参与炎症反应病理生理过程的一种重要物质，有研究表明^[29]，MMP9可参与了偏头痛的病理生理过程。TNF因子在调节免疫功能的同时，过量可造成对组织的损伤^[30]，参与偏头痛的发生。因此，头痛宁胶囊呈现出的多分子、多靶点协同作用优势明显，主要活性成分可参与TNF通路的调节作用，对偏头痛发病机制各环节的调节，从而达到治疗偏头痛的目的。

此外，从结果中还可以看出，同一种药物成分往往作用于多个靶标，每个靶标至少与2个以上的化合物相联系，例如：白藜芦醇为制何首乌药效成分，与8个靶标均有作用，β-谷甾醇是防风所含化合物，作用于PTGS2，IL6，JUN，RELA和TNF这5个靶标，当归中的香兰素和汉黄芩素分别作用于2个（PTGS2和JUN）和3个靶标（PTGS2，JUN和MMP9），这些结果也体现了中药复方多成分、多靶标的作用特点。

3 结论

本研究采用系统药理学方法对头痛宁胶囊治疗偏头痛的TNF通路进行研究，通过ADME预测、靶标识别、网络构建与分析，从“药物-靶点-疾病”关联性对头痛宁胶囊治疗偏头痛的相关作用机制进行分析，能够作用于偏头痛相关的TNF通路中8个靶标为关键作用靶标，19个化合物为潜在关键活性成分，为头痛宁胶囊药效物质基础及作用机制研究提供了一种新的研究策略，为该制剂药效标志物的确定及临床研究提供了必要的理论依据。

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[責任编辑 张宁宁]