大鼠死后肌肉电导率与腐败程度的关系

夏志远，翟仙敦，刘蓓蓓，郑哲，赵琳琳，莫耀南

（河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003）

大鼠死后肌肉电导率与腐败程度的关系

夏志远，翟仙敦，刘蓓蓓，郑哲，赵琳琳，莫耀南

（河南科技大学法医学院，河南洛阳 471003）

目的分析大鼠死后肌肉电导率（electrical conductivity，EC）、肉类食品腐败程度指标挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）与死亡时间（postmortem interval，PMI）的关系，探讨EC作为尸体肌肉腐败程度评价指标的可行性，为该法用于PMI推断奠定理论基础。方法健康SD大鼠颈椎脱臼处死后，保存在28℃环境中，于死后不同时间点提取大鼠后肢肌肉组织，用去离子水制成质量浓度为0.1g/mL的肌肉浸渍液，并测量所得浸渍液的EC值和TVB-N含量。分析EC（x1）与TVB-N（x2）的相关性，建立二者关系的回归方程；分析两指标与PMI的相关性，并分别建立两指标与PMI（y）关系的回归方程。结果肌肉浸渍液EC、TVB-N随PMI的变化曲线走势基本相同；EC与TVB-N呈显著直线正相关，回归方程为x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）；EC、TVB-N与PMI显著相关，回归方程分别为结论大鼠死后肌肉EC与TVB-N变化趋势一致，可以作为反映尸体肌肉腐败程度的指标，为腐败尸体PMI推断的相关研究提供方法。

法医病理学；腐败程度；肌，骨骼；电导率；挥发性盐基氮；死亡时间；大鼠

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断是法医学研究的难点问题，寻找客观、精准且便于在实践中推广的方法一直是法医学者的重要任务。目前，通过蛋白质、核酸等生物大分子的变化规律，光谱技术以及昆虫在尸体上的生长规律等来推断PMI是当前的热点研究方法[1]。然而，尸体死后变化复杂，各种方法均有其局限性，且大多数方法都处于理论研究阶段，寻求新的PMI推断方法具有重要意义。

随着“转化医学”在法医学领域的渗透，引进其他学科成熟的技术手段来解决法医学领域的问题是一种思路。食品科学对于肉类品质的研究已经有近百年历史，目前已有可用于评价肉类新鲜程度和货架期的指标。其中，挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）是肉制品中各种蛋白质在细菌和酶的作用下产生的一组碱性含氮物质，因而与肉制品腐败程度有着明确的对应关系[2，3]。TVB-N的经典测定方法为凯氏定氮法，该方法具有较高的精准度，因而早已应用于食品科学不同肉类腐败程度的评定[4-7]；此外，TVB-N也是我国国家标准中唯一用于评价肉类食品新鲜程度的理化指标[8]。然而，TVB-N的测定耗时且技术要求较高，不利于在实践中推广。食品科学领域学者在寻找快速准确测定肉类腐败程度和货架期指标的过程中，发现不同种肉类浸渍液电导率（electrical conductivity，EC）与TVB-N具有良好的线性关系，浸渍液EC测定方法简单、快速，有利于在实践中进行[9-11]。

但是，食品科学研究的对象仅限于肉眼无法辨别是否变质的肉类样本，而法医学的研究对象既可能是轻度腐败尸体，也可能是高度腐败尸体，因此食品科学EC和TVB-N的测定方法无法直接应用于尸体肌肉腐败程度的测定。在前期研究[12，13]中，本课题组分别建立了适用于不同腐败程度尸体肌肉的EC和TVBN测定方法。本研究拟将大鼠尸体放置恒温环境，于死后不同时间段取样并测定样本的EC值和TVB-N含量。在此基础上，分析EC、TVB-N和PMI两两之间的关系，最终探讨EC作为尸体肌肉腐败程度评价指标的可行性及其在PMI推断研究中的意义。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

DDS-11A微机型精密电导率仪（杭州奇威仪器有限公司），DV215CD电子天平（美国OHAUS公司），Milli-Q Biocel A10超纯水系统（美国Millipore公司），半微量凯氏定氮装置（上海满贤经贸有限公司），0.1mol/L盐酸标准液（深圳市拓成科技有限公司），氧化镁、硼酸（国产分析纯）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

SD雌性大鼠66只（洛阳市实验动物研究中心提供），体质量（290±20）g，随机分成11组，每组6只，麻醉后颈椎脱臼处死，以仰卧位放入泡沫箱内，用透气良好的丝绸封住箱口以防止昆虫干扰。将封好的泡沫箱放置于室内28℃空调环境中保存。在死后即刻（0 d）和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d共11个时间点分别取一组大鼠用于制备肌肉浸渍液。

1.2.2 肌肉浸渍液的制备

提取每只大鼠后肢肌肉5g移入研钵中剪碎，加入50mL超纯水，用剪刀边搅拌边将组织剪成匀浆，30min后将液体过滤，所得滤液即为质量浓度为0.1g/mL的肌肉浸渍液。

1.2.3 EC值的测定

实验室温度计（煤油型）测定肌肉浸渍液实际温度，调整电导率仪显示温度，使之与浸渍液温度相同。将电导率仪探头浸没在浸渍液中，仪器按照2%/℃进行温度补偿，所测得值（25℃）即为肌肉浸渍液的EC值[12]。

1.2.4 TVB-N含量的测定

TVB-N测定依次包括蒸馏、吸收、滴定和计算4个过程。其中蒸馏、吸收和计算过程主要参照国家标准[8]，滴定过程参考Xia等[13]的TVB-N电导滴定法，以下为TVB-N主要操作过程。蒸馏与吸收：5mL浸渍液和20mL氧化镁（40mg/L）移入蒸馏管中蒸馏，蒸汽经过冷凝后，被50mL硼酸（20mg/L）吸收。滴定：将电导率仪探头浸没在上述硼酸吸收液中，使用量程为100μL的移液枪，以每次50μL体积向吸收液中移加0.1 mol/L的标准酸，并记录消耗的标准酸体积和对应的EC值，当EC值发生突变时（突然明显增大），继续移加5次，并记录EC值，EC突变时即反应达到终点。计算：参照国家标准，结果以mg/100g表示。

1.3 数据处理

采用OriginPro 8软件（美国OriginLab公司）对数据进行分析。以EC（x1）为自变量，TVB-N（x2）为因变量，建立两指标关系的回归方程。以EC（x1）、TVB-N（x2）为自变量，PMI（y）为因变量，分别建立PMI与EC、TVB-N两因素关系的回归方程。

2 结果

EC、TVB-N随PMI的变化结果见表1，两指标整体变化趋势基本一致。EC和TVB-N随PMI变化规律显示，在28℃左右，尸体的腐败大致可以分为三个阶段：腐败早期（1 d内），两指标有所增加，但变化不明显，肌肉EC日平均增长速度约为200 μs/cm，而TVB-N日平均增长速度约为10 mg/100 g；快速腐败期（2～4 d），两指标迅速上涨，肌肉EC由（1 459.33± 195.01）μs/cm增加到（4 618.33±1 069.12）μs/cm，日平均增长速度约为1 000μs/cm，TVB-N则由（29.87± 29.35）mg/100 g增加到（469.00±169.57）mg/100 g，日平均增长速度约为150mg/100g；缓慢腐败期（5～10d），两指标增长速度变慢，肌肉EC日平均增加量约为350μs/cm，TVB-N日平均增加量约为50mg/100g。

表1 EC、TVB-N随PMI的变化（n=6，±s）

表1 EC、TVB-N随PMI的变化（n=6，±s）

PMI/dEC/（μs/cm）TVB-N/（mg/100g）01278.33±21.0118.67±2.89 11459.33±195.0129.87±29.35 22685.67±982.71212.80±139.04 34203.33±518.64382.67±88.40 44618.33±1069.12469.00±169.57 54605.00±928.37464.33±135.28 65656.67±1017.62581.00±144.61 75465.00±538.84567.00±66.11 85605.00±497.54597.33±68.39 96271.67±653.53697.67±113.19 106773.17±763.68767.67±107.51

大鼠肌肉浸渍液EC（x1）与TVB-N（x2）呈线性相关，线性回归方程为x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）。

EC（x1）值随着PMI（y）的延长逐渐增加，曲线回归方程为

TVB-N（x2）含量随着PMI（y）的延长逐渐增加，曲线回归方程为

3 讨论

尸体死后变化复杂，寻找新的PMI推断方法是实现多途径PMI推断的重要过程。目前，食品科学对肉类新鲜程度和货架期的研究已经非常成熟，利用该领域的成熟指标来研究解决法医学PMI问题，是一种新思路。EC和TVB-N均为食品科学领域分析肉制品中各种大分子总体降解规律的指标。首先，TVB-N是肉类新鲜程度的重要评价指标，其测定结果所代表的是各类蛋白质大分子时序性降解所产生的含氮产物的总量。因此，与研究某一种蛋白分子变化规律相比，TVB-N更能体现蛋白质降解的整体变化规律。与TVB-N相似，EC的时序性增长所体现的是肉类组织内蛋白质、核酸、脂肪等各种大分子总体降解程度的变化，具体来说，在细胞自身酶的作用下，细胞膜开始破裂，电解质不断流向细胞外，同时，由于细菌和酶的作用，蛋白质、核酸、脂肪等大分子逐级降解，产生了大量的导电小分子物质，从而增加了肌肉组织的导电性，EC测定方法简便、快速[14]，有利于在实践中推广。

然而，食品科学对于TVB-N和EC的研究仅限于早期肉眼无法明确是否变质的肉类样本，而本实验研究了TVB-N和EC是否也可用于高度腐败尸体肌肉腐败程度的测定。研究[15]表明，尸体腐败进程受环境温度影响最大。本研究将大鼠处死后保存于28℃环境中以消除温度的影响，同时尽可能控制大鼠的体质量、性别，并采取相同的处死方式及保存条件，降低其他变量可能造成的影响。与人尸体相比，大鼠尸体体积较小，蝇蛆可在数天内将其软组织食尽，为了避免蝇蛆可能对后期取材的影响，将大鼠尸体保存于泡沫箱内，并用透气良好的丝绸封住箱口，从而延缓了腐败进程，保证了后续工作有效进行。食品科学TVB-N测定方法复杂，如酸碱指示剂需现配现用、滴定终点颜色变化细微、样本腐败程度越大滴定所需时间越长等，致使该法不能直接用于大鼠尸体腐败肌肉的测定。本实验肌肉浸渍液TVB-N测定过程中，采用了电导滴定法，即用电导率仪动态监测酸碱滴定过程中离子变化过程，当待测液体EC值突然增大时，提示反应达到终点，从而消除了不同实验者由于颜色敏感度不同所造成的误差。在肌肉浸渍液EC的测定过程中，为了保证测量的精准性，将肌肉组织剪碎制成匀浆并均质了30min，从而保证了离子充分浸渍到水中，此时肌肉浸渍液EC已达到最大值，继续剪切搅拌，EC值不再变化。为了消除液体在不同温度下测量EC结果的差异，本研究测定了浸渍液的实际温度，并设置了仪器参数，使之按照补偿系数2%/℃进行自动温度补偿，从而使测量值转化为25℃标准温度下测定值。

本实验不同PMI大鼠肌肉EC和TVB-N的研究结果表明，两指标均随PMI延长而上涨，且两曲线整体变化趋势相同；EC与TVB-N呈高度线性相关，进一步说明两指标在腐败程度量化上的一致性。此外，两指标随PMI的阶段性变化与目前法医学对尸体腐败的大致分期以及微生物学对细菌增长曲线的分期（调整期、对数期、稳定期）基本一致。而对猪肉品质变化规律的研究[9，16]表明，猪肉EC在1 d内有显著变化，本实验大鼠肌肉EC变化结果与其有一定的差异。其可能原因为大鼠肌肉表面有皮肤保护，不利于大鼠肌肉与环境细菌的接触。而与Byrne等[17]对牛尸体肌肉电特性研究相比，本研究中EC的变化趋势与其研究结果基本一致。与周睿卿等[18]家兔玻璃体液EC推断PMI的研究相比，两种样本EC随PMI变化走势相似，但该研究认为眼球到后期会腐败破裂，存在玻璃体液采集困难的问题。就这一方面而言，利用肌肉EC推断PMI更有优势。由上述分析可知，肌肉EC对于腐败尸体的PMI推断更有意义。本实验分析了大鼠肌肉EC和TVB-N与PMI的相关性，结果表明，大鼠死后肌肉EC与TVB-N变化规律一致，EC可以客观、准确地反映尸体肌肉腐败程度。肌肉EC测定方法简便、实用，可以为后续尸体腐败与腐败影响因素之间的具体量化研究提供方法基础。

参考文献：

[1]马剑龙，陈龙.死亡时间推断的方法学研究进展[J].中国法医学杂志，2015，30（5）：478-481.

[2]Huang L，Zhao J，Chen Q，et al.Nondestructive measurement of total volatile basic nitrogen（TVB-N）in pork meat by integrating near infrared spectroscopy，computer vision and electronic nose techniques[J]. Food Chem，2014，145：228-236.

[3]刘雪云.挥发性盐基氮检测方法的现状及研究方向[J].农产品加工（学刊），2014，（1）：51-53.

[4]黄星奕，蒋飞燕，穆丽君，等.基于嗅觉可视化的鲳鱼TVB-N预测模型[J].江苏大学学报（自然科学版），2013，34（1）：38-43.

[5]贾培红，张坤生，任云霞.TVB-N与肉品储藏温度的关系研究[J].肉类研究，2010，（8）：63-66.

[6]马世榜，彭彦昆，徐杨，等.可见/近红外光谱结合变量选择方法检测牛肉挥发性盐基氮[J].江苏大学学报（自然科学版），2013，34（1）：44-48.

[7]史智佳，田寒友，邹昊，等.MWPLS法在羊肉中TVB-N近红外定量分析中的应用[J].食品科学，2015，36（20）：218-221.

[8]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.肉与肉制品卫生标准的分析方法：GB/T 5009.44—2003[S].北京：中国标准出版社，2003.

[9]杨秀娟，张曦，赵金燕，等.应用电导率评价猪肉的新鲜度[J].现代食品科技，2013，29（5）：1178-1180，1191.

[10]张丽娜，罗永康，李雪，等.草鱼鱼肉电导率与鲜度指标的相关性研究[J].中国农业大学学报，2011，16（4）：153-157.

[11]周冬香，陈椒，徐朝霞，等.电导法快速检测淡水鱼新鲜度的方法研究[J].食品科学，1998，19（6）：39-42.

[12]Xia Z，Zhai X，Liu B，et al.Determination of electrical conductivity of cadaver skeletal muscle：a promising method for the estimation of late postmortem interval[J].J Forensic Sci Med，2015，1（1）：16-20.

[13]Xia Z，Zhai X，Liu B，et al.Conductometric titration to determine total volatile basic nitrogen（TVB-N）for post-mortem interval（PMI）[J].J Forensic Leg Med，2016，44：133-137.

[14]Ekanem EO，Achinewhu SC.Effects of shucking method on opening，meat yield and selected quality parameters of West African Clam，Galatea paradoxa（Born）[J].J Food Process Pres，2000，24（5）：365-377.

[15]Vass AA.The elusive universal post-mortem interval formula[J].Forensic Sci Int，2011，204（1-3）：34-40.

[16]Oliver MA，Gispert M，Tibau J，et al.The measurement of light scattering and electrical conductivity for the prediction of PSE pig meat at various times post mortem[J].Meat Sci，1991，29（2）：141-151.

[17]Byrne CE，Troy DJ，Buckley DJ.Postmortem changes in muscle electrical properties of bovine M.longissimus dorsi and their relationship to meat quality attributes and pH fall[J].Meat Sci，2000，54（1）：23-34.

[18]周睿卿，张付，王晔，等.家兔死后玻璃体液电导率变化与死亡时间的关系[J].法医学杂志，2008，24（1）：12-14.

Relationship between Electrical Conductivity and Decomposition Rate of Rat Postmortem Skeletal Muscle

XIA Zhi-yuan,ZHAI Xian-dun,LIU Bei-bei,ZHENG Zhe,ZHAO Lin-lin,MO Yao-nan
（School of Forensic Medicine,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China）

ObjectiveTo analyze the relationship among electrical conductivity（EC）,total volatile basic nitrogen（TVB-N）,which is an index of decomposition rate for meat production,and postmortem interval（PMI）.To explore the feasibility of EC as an index of cadaveric skeletal muscle decomposition rate and lay the foundation for PMI estimation.MethodsHealthy Sprague-Dawley rats were sacrificed by cervical vertebrae dislocation and kept at 28℃.Muscle of rear limbs was removed at different PMI,homogenized in deionized water and then skeletal extraction liquid of mass concentration 0.1 g/mL was prepared.EC and TVB-N of extraction liquid were separately determined.The correlation between EC（x1）and TVB-N（x2）was analyzed,and their regression function was established.The relationship between PMI（y）and these two parameters were studied,and their regression functions were separately established.ResultsThe change trends of EC and TVB-N of skeletal extraction liquid at different PMI were almost the same,and there was a linear positive correlation between them.The regression equation was x2=0.14x1-164.91（R2=0.982）.EC and TVB-N of skeletal muscle changed significantly with PMI,and the regression functions were y=19.38x13-370.68x12+2526.03x1-717.06（R2=0.994）,and y=2.56x23-48.39x22+ 330.60x2-255.04（R2=0.997）,respectively.ConclusionEC and TVB-N of rat postmortem skeletal muscle show similar change trends,which can be used as an index for decomposition rate of cadaveric skeletal muscle and provide a method for further study of late PMI estimation.

forensic pathology;decomposition rate;muscle,skeletal;electrical conductivity;total volatile basic nitrogen;postmortem interval;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.004

1004-5619（2017）01-0017-04

2015-10-08）

（本文编辑：邹冬华）

河南省基础与前沿课题资助项目（112300410082）

夏志远（1988—），男，硕士研究生，主要从事法医病理学研究；E-mail：forensic-science@qq.com

莫耀南，男，教授，硕士研究生导师，主要从事法医病理学和法医临床学研究；E-mail：forensic@haust.edu.cn