潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水微生物特性及机制

胡林潮　周新程　邓文　陈萍　陈晶　张文艺

摘要：为揭示潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水微生物特性及机制，以位于常州市城北污水处理厂内的潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水旁路试验系统中的植物根系、湿地填料及湿地土壤中微生物为研究对象，通过镜检、脲酶、磷脂脂肪酸（PLFA）等分析手段对其进行相关研究。结果表明，植物根系、填料中含有团藻等菌胶团和轮虫、变形虫等原生动物，团藻等菌胶团通过自身新陈代谢及光合作用，利用尾水中N、P进行生物代谢，去除低碳源条件下尾水中的N、P等。湿地脲酶平均含量（N）约为22.43mg/g，其活性与TN的去除呈线性相关，活性越高，TN去除率越高。消纳城市污水厂尾水湿地填料中饱和脂肪酸（PLFA）含量为99.30%，不饱和脂肪酸含量仅为0.70%，这与潜流式人工湿地处理城市污水中的PLFA含量有很大差别（分别为76.97%、23.03%）。以脂肪酸生物标记量为指标，显示湿地填料中形成了以好养细菌为优势种群的微生物生态结构。团藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要载体微生物。

关键词：尾水；磷脂脂肪酸；脲酶；人工湿地

中图分类号：X701

文献标志码：A

文章编号：1674-4764（2016）06-0135-07

潜流式人工湿地生态消纳城市污水厂尾水技术近年来在中国南方地区一些污水处理厂提标改造中得到应用，该技术主要通过湿地基质、湿地植物、微生物的协同作用对污水厂尾水进行消纳。由于城市污水厂尾水碳含量低，总氮及硝酸盐氮含量较高，c、N、P营养比约为54：17：1，难以达到传统生物法处理城市污水微生物所需c、N、P营养比100：5：1。这种基于湿地填料多因素协同作用下的尾水生态消纳，其微生物特性与传统潜流式人工湿地处理城市污水可能存在差异。有关湿地土壤层微生物特性的研究已有报道，崔伟等通过对湿地脲酶活性的测定有可能建立衡量湿地去除效果的模式体系，且得出湿地脲酶活性与TN去除率呈正相关性；Sanz-Cobena等研究表明土壤有机氮转化为无机氮的强度可用脲酶活性来反映，脲酶活性是评价氮素转化机制的指标之一；王震宇等口通过DAPI染色法、FDA染色法和稀释平板法发现黄河三角洲退化湿地微生物数量、活性及多样性与土壤盐度呈显著负相关；Richard等通过PLFA谱图研究发现真菌在低肥力的土壤生化过程中发挥重要作用。

潜流式人工湿地主要通过湿地微生物消纳城市污水厂尾水，对尾水有一定的脱氮除磷效果，在中国已有应用，但在低碳源条件下对湿地微生物的研究报道相对较少。本研究以潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水为试验研究对象，通过镜检湿地介质（填料、底泥土壤、植物根系等）中的生物膜，检测湿地土壤脲酶活性和磷脂脂肪酸（PLFA）指标，揭示低碳源、高总氮、高硝酸盐氮条件下潜流式人工湿地微生物功能、活性、多样性和群落结构等方面特性。

1.材料与方法

1.1尾水消纳旁路试验系统及其运行效果

试验地点为江苏省常州市城北污水处理厂内，如图1所示。

人工湿地剖面如图2所示。湿地呈长方体结构，宽（B）2.0m，总长（L）8.0m，深（H）1.5m。其中进水池长（L₁）0.5m，调节池长（L₂）0.5m，人工湿地主体长（L₃）6.0m，沉淀池长（L₄）0.5m，集水池长（L₅）0.5m，孔隙率40%，有效容积9.6m³，日处理水量为5～8m³，水力负荷0.31～0.50m³/（m²·d）。尾水依次流過湿地进水池、调节池、湿地主体，最后进入收集池，通过管道输送至尾水排放口。通过流量计和调节阀门控制进水流量.湿地内部采用石灰石、钢渣、陶粒、红砖作为湿地填料，充填高度1.2m，填料上部铺设无纺布，再在无纺布上层铺0.25m厚土壤，种植黄花鸢尾、菖蒲、美人蕉、梭鱼草等挺水植物，无纺布可以阻断土壤下渗到湿地填料中堵塞湿地，同时，无纺布具有透水性，不会阻断水流，植物的根系也可以穿透无纺布向下伸展。

试验土建工程于2013年12月开工，2014年1月进行管道安装，2月正式运行。经18个月连续运行，除TN外，可使消纳尾水的COD、NH₃-N、TP等指标由《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级B排放标准，降解达到《地表水环境质量标准》（GB3838-2002）V类水质要求（表1所示）。

1.2样品采集

1）微生物镜检样品的采集，使用灭菌后的玻璃采样仪器，用镊子和小刀刮取湿地介质填料和植物根系表面的生物膜，制作载玻片，并立即分析。

2）中试湿地土壤的采集：1）中试脲酶活性土壤的样品采集，从2014年7-11月之间每月采集一次，土壤采集深度20cm，分别采集湿地前端、中部、后端的土壤样品，样品前端、中部、后端分别平行设置3个点，分析土壤为3个采集点的混合土壤，土壤采集后，自然风干；2）中试湿地磷脂脂肪酸土壤的样品采集，于2014年11月份采集，采集深度为20cm，湿地中均匀设置前中后3个采集点，分析样品为3个采集点的混合样品。土壤采集后冷冻于-20℃冰箱，分析测定时取用。

1.3检测方法

1.3.1微生物镜检生物相镜检采用XDS200PH倒置生物显微镜观测，生物相识别参考《环境微生物图谱》。

1.3.2土壤脲酶活性检测湿地土壤的脲酶活性采用奈氏比色法测定，具体方法为：称取5g风干后的土壤样品，放置于100L锥形瓶中。加入10mLpH6.7的磷酸缓冲液和0.5mL甲苯，摇匀，混合处理15min.再加入10mL10%尿素溶液（对照以水代替），置于37℃恒温培养箱培养48h。培养结束后，加入20mL的1mol/LKCl，震荡摇匀10min。将混合液通过滤纸过滤，吸取0.1mL滤液置于25mL比色管中，用蒸馏水稀释至10mL，摇匀，加入4mL的1mol/LNaOH，显色，稀释至25mL刻度处。静置10min，以空白样品作对照，在波长460nm处测定其吸光度。

1.3.3磷脂脂肪酸的测定磷脂脂肪酸（PLFA）测定，参照Bligh法以及本课题组论文，主要测试步骤为：①脂肪酸的提取；②PLFA的分离；③PLFA的甲酯化；④PLFA样品的提取和测定。待测样品用GSMS-QP2010气相色谱质谱联用仪分析，色谱柱为DB-5-MS（30m×250um×0.25um）毛细管柱，氦气作为载气，不分流进样，扫描方式：SIM。

2.结果与讨论

2.1湿地微生物镜检

采用倒置生物显微镜对湿地植物根系和湿地填料进行镜检，结果如图3所示。其中，（a）是湿地植物根系在倒置显微镜下拍摄出的图片，可以看出植物根系有生物膜菌胶团等少量微生物附着在其表面。（b）为湿地出水口处土壤中镜检出的团藻。（c）、（d）是湿地填料上镜检出的微生物，分别为轮虫和变形虫等原生动物。人工湿地植物根系具有泌氧作用，有较多好氧微生物附着在植物根系上，同时，填料表面也是微生物附着的地方，由于填料比表面积较大，填料和植物根系能够截留尾水中的污染物，微生物以这些污染物为食，并同化为自身的一部分，从而降解尾水中的污染物。同时，湿地出水口处发现有团藻，说明在低碳源条件下，团藻通过光合作用，利用尾水中的N、P等污染物进行生物代谢，从而实现低碳源条件下对尾水中N、P的去除。

2.2湿地土壤脲酶活性

脲酶是湿地土壤中氮转换的关键酶，其作为一种生物催化剂，能促进尾水中含氮有机物的分解，同时，脲酶活性可作为湿地对含氮有机污染物净化能力的衡量指标。表2为2014年7-11月湿地前、中、后端土壤脲酶活性变化情况。从月变化看，湿地脲酶含量从7-10月一直处于增长状态，到10月达到最大，平均脲酶含量（N）为37.01mg/g，11月有所下降。其中，湿地前端、中部、后端的脲酶含量（N）平均值分别是22.15、24.79和20.35 mg/g。由于尾水碳含量低，总氮及硝酸盐氮含量较高，C、N、P营养比难以达到传统生物法处理城市污水微生物所需营养比条件，导致湿地脲酶活性平均含量（N）为22.43mg/g，与吴振斌等研究人工湿地植物根区土壤酶活性与污水净化效果及其相关分析所测得的脲酶活性（N）平均值260mg/g存在较大差异。

湿地前端和中部的平均脲酶含量高于湿地后端的平均脲酶含量，即湿地前端和中部的脲酶活性高于湿地后端的脲酶活性，脲酶活性大体上沿程下降。湿地系统中氮素和有机质污染物在沿程中被降解，沿着水流方向慢慢减少，从而导致微生物的数量、活性、多样性等降低，脲酶活性也随之降低。这与黄娟等关于潜流式人工湿地土壤中、上层脲酶活性高于土壤下层脲酶活性的研究结果有一定不同。

这与邓风等研究发现潜流湿地土壤脲酶活性与TN的去除率之间存在显著正相关这一结果存在差异。可能由于城市污水厂尾水中TN含量远远低于城市污水中TN含量，导致消纳尾水湿地土壤脲酶活性与TN去除率之间相關性不显著。

2.3湿地土壤PLFA

对湿地土壤中提取的PLFA的GC-MS图谱进行分析如下（见表3），表3列出了湿地土壤中的脂肪酸所标记的微生物及其生物标记量等。共检测出3种磷脂脂肪酸，且湿地土壤中微生物均为细菌，且好氧细菌占绝大部分并有部分放线菌。其中不饱和脂肪酸9Mel9：0在湿地土壤中含量为0.054nmol/g，含量最少；其次是饱和脂肪酸i18：0，其含量为0.271nmol/g；最多是饱和脂肪酸17：0，其含量为0.508nmol/g。根据White等研究得出PLFA量和生物量之间在的转换系数，取4×10⁴cell·pmol^-1推算出饱和脂肪酸17：0的生物标记量为20.32×10⁶cell/g，指示微生物为好氧细菌；饱和脂肪酸i18：0和不饱和脂肪酸9Mel9：0的生物标记量分别为0.22×10⁶cell/g和10.84×10⁶cell/g，指示微生物都为放线菌。由此可知，运用人工湿地生态消纳城市污水厂尾水，使得湿地土壤中形成了以好氧细菌为优势种群的微生物生态结构。

运用PLFA法检测尾水消纳湿地填料底泥，检测出的脂肪酸种类相对较少、不饱和脂肪酸含量占极少部分以及未检测出真菌、假单胞杆菌、嗜热解氢杆菌等存在，这与尹勇等运用PLFA法研究生态强化法原位净化村镇污水微生物特性的结果存在明显差异。这可能是由于城市污水厂尾水中碳含量低，总氮及硝酸盐氮含量较高，C、N、P营养比难以达到传统生物法处理城市污水微生物所需营养比条件，导致微生物特性与传统潜流式人工湿地处理城市污水存在以上差异。

2.4低碳源条件下的尾水人工湿地消纳微生物作用机制

低碳源条件下，人工湿地对尾水中的污染物降解主要基于以下3种途径：

1）由于嗜磷菌在溶解氧小于2mg/L的情况下将会释放，所以污水处理厂尾水的DO大多为2.0～4.0mg/L。当低碳源的尾水进入潜流湿地时（HRT=20～24h），除本身含有一定浓度氧外，湿地植物根区根系具有泌氧作用，因此，潜流湿地是一个以好氧环境为主的微生态系统。湿地填料表面及湿地植物根系表面及周围形成了以好氧微生物为主的氧化区域，尾水中有机污染物被好氧微生物利用、降解和分解。

2）具有一定比表面积的石灰石、钢渣、陶粒、红砖构成的湿地填料及其表面生长的微生物膜，通过截留、过滤、吸附等过程消减尾水中的污染物和SS，表现出水COD、TN、TP、氨氮及SS的同步降低。尾水中COD含量低、总氮及硝酸盐氮含量较高，氮主要通过湿地填料表面的微生物膜硝化和反硝化作用以及氨的挥发等过程被去除，湿地填料间隙和植物根系之间能够形成多个好氧一厌氧微区域，湿地微生物能够利用这些微区域对尾水中的氮进行硝化和反硝化作用，从而降解、转化尾水中的氮素。尾水中磷的去除途径是通过微生物对磷的同化吸收以及自然沉降、填料吸附等，由于湿地植物的光合作用和呼吸作用的进行，交替出现了好氧和厌氧环境，使得微生物对磷的同化作用更易进行。

3）由于湿地系统是一个有氧生态系统，其中生长有一定数量的藻类微生物，其对湿地系统的脱氮、除磷也有一定的贡献。藻类微生物（如团藻）可能通过光合作用或自身新陈代谢作用，利用尾水中的N、P等污染物进行生物代谢，从而实现低碳源条件下对尾水中N、P的去除。

3.结论

潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水的湿地系统是好氧生态系统，PLFA揭示该系统中形成了以好氧细菌为优势种群的微生物生态结构。湿地填料和植物根系表面生物膜及悬浮团藻，能同化植物根系和湿地填料截留下的污染物质，降解尾水中的污染物；低碳源条件下，团藻、好氧微生物是低碳源尾水中TN等污染物去除的主要载体微生物；湿地脲酶活性与TN的去除呈线性相关，活性越高，TN去除率越高；一定的溶解氧浓度水平和脲酶活性是湿地消纳尾水调试及运行重要控制指标。本研究对潜流式人工湿地消纳城市污水厂尾水微生物特性及机制的研究有着重要的意义。