发酵生产维生素B12的检测与提取研究

2017-03-30 02:05王利杰
科技与创新 2016年22期
关键词:发酵液高效液相色谱法超声波

王利杰

摘 要:采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测了发酵液中维生素B12的含量,使用费氏丙酸杆菌细胞破碎提取维生素B12。结果显示,羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素的回收率分别为92.43%,97.56%和96.45%.费氏丙酸杆菌的质量浓度分别为43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。经超声波破碎,经测定,维生素B12的产量分别为13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。维生素B12经微波加热法获得的提出率最大,其次为煮沸法、超声法和高压均质法。HPLC具有良好的重复性和较快的分析速度,而在费氏丙酸杆菌细胞破碎提取中,微波加热法和煮法法值得推广。

关键词:发酵液;维生素B12;高效液相色谱法;超声波

中图分类号:TQ924 文献标识码:A DOI:10.15913/j.cnki.kjycx.2016.22.106

维生素B12又被称为钴胺素,主要是通过微生物发酵获取的,其被广泛应用于医药、食品工业等方面。在实践中,常见的检测方法有微生物法、间接检测法等,其中,HPLC的使用频率最高。但是,因为维生素B12的发酵周期过长、发酵物种繁多,所以,急需构建准确、简便、高效的检测方法。目前,关于维生素B12的检测和提取的研究报道比较少。因此,本文利用HPLC检测了维生素B12,并借助大孔树脂吸附法进行了提取,效果显著,具体情况如下。

1 实验材料

实验一:费氏丙酸杆菌,质量分数为5%的玉米浆,质量分数为2%的葡萄糖,质量分数为0.2%的硫酸铵,高效液相色谱仪,超声波细胞破碎仪,高速离心机,大容量离心机,纯水机,分析纯,色谱柱为5 μm,(4.7×25.0)cm。

实验二:菌种、培养基同实验一,采用高效液相色谱仪,高速离心机,大容量离心机,超声波细胞破碎仪,微波炉,高压均质机,考马斯亮蓝染液,色谱柱5 μm,(4.7×25.0)cm。

2 实验方法

实验一:培养费氏丙酸杆菌,利用生理盐水清洗菌体,静置30 ℃,培养50 h。接种发酵培养基后,静置30 ℃,培养100 h,发酵后40 h,添加二甲基苯并咪唑,诱导菌体,积累维生素B12,离心4 000 r/min,获取菌体。具体实验有,重复性实验、稳定性试验、回收率实验,即称取5份菌体,质量相同,制备样品,添加等量羟基钴胺素和甲基钴胺素,置于4 ℃冰箱内,避光保存,检测间隔时间为1 h/次,分析样品5 h内的稳定性。

实验二:配置不同浓度的血清白蛋白溶液,取0.1 mL,加入考马斯亮蓝染液5 mL。维生素B12的提取方法有4种,即超声法,称取菌体,放置在小烧杯内,离心后,溶解菌体,选取不同时间,探讨其提取效率,取上清,测定蛋白质释放率,除蛋白质后测定维生素B12的含量;煮沸法,定容后,煮沸,离心,过滤上清液后,测定维生素B12的含量。此外,还包括微波加热法和高压均质法,此处不一一阐述。

3 实验结果

实验一:细胞破碎液处理后,获得了HPLC色谱图,羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素均在25 min内完全分离,各自保留时间为10.9 min、18.5 min、22.4 min,细胞破碎液中杂质6 min内被洗脱,借助梯度洗脱,分离了脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。三类不同浓度的钴胺素与色谱峰面积呈线性关系,因其对光线敏感,操作时应避光,质量浓度为10~200 μg/mL,三者线性关系良好。维生素B12经重复性实验,5次实验标准偏差均低于2.5%,均在允许误差范围内。此结果表明,仪器具有较高的精密度,分析方法具有良好的重复性。稳定性实验,维生素B12置于避光环境中,5 h内稳定,三者的回收率分别为92.43%,97.56%,96.45%. 费氏丙酸杆菌的质量浓度分别为43.43 g/L、42.32 g/L、39.64 g/L。经超声波破碎,测定维生素B12的产量分别为13.54 mg/L、14.53 mg/L、14.96 mg/L。

实验二:费氏丙酸杆菌菌体采取不同的方法提取维生素B12,提出率最大的为微波加热法,其次为煮沸法、超声法和高压均质法,分别为100.00%,97.67%,89.65%和88.63%.

4 讨论

经微生物发酵获取维生素B12常见的有羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。为了快速测定发酵液中维生素B12的含量,本文采用了HPLC方法,离心后,得到了菌体,待预处理后使用醋酸钠缓冲液为流动相。实验结果为检测方法精准。在钴胺素类物质检测中使用HPLC,优势显著,准确、快速,具有良好的重复性。因此,该方法可用于钴胺素工业发酵生产。在实践过程中,可以对维生素B12进行定量分析,其应用价值显著,值得推广。

维生素B12为细胞内产物,在提取时关键环节便是破碎细胞,其对产物有直接的影响,比如活性、收率、成本等。因此,在實践过程中,应确保细胞破碎方法具有合理性、针对性和有效性。目前,常见的细胞破碎方法有2种,一种为机械法,另一种为非机械法,前者包括株磨法、超声波法,后者包括化学法、物理法等。为了指导实践,使维生素B12提取更加简便,本文对比了不同提取方法,取得了良好的效果。其中,微波加热法的提取时间最短,但是,在工业应用中,需要借助大型配套设备。此外,煮沸法优点显著,提取效率高,处理量大,仅需简单的设备,值得推广。

参考文献

[1]王泽建,赵琳琳,储炬,等.脱氮假单胞菌生产维生素B12过程中粪卟啉Ⅲ的测定及发酵调控[J].中国生物工程杂志,2011,14(08):47-53.

[2]李志春,郭海蓉,麻少莹,等.甘蔗糖蜜发酵液中维生素B12提取方法的比较[J].南方农业学报,2013,10(07):1710-1713.

〔编辑:白洁〕

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