黄曲霉毒素G1与人血清白蛋白的结合机理及分子对接

钟 红，王佳曼，马 良，江 涛

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

黄曲霉毒素G1与人血清白蛋白的结合机理及分子对接

钟 红，王佳曼，马 良*，江 涛

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

在模拟人体血液pH 7.4的条件下，用分子对接及其荧光光谱、3D荧光、圆二色谱等方法研究黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1） 与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的相互作用。结果发现，根据双对数方程得出AFG1与HSA结合反应猝灭机制为静态猝灭，4 个温度条件下结合常数数量级均为104，结合位点数近似为1。通过分子对接和热力学参数计算，AFG1结合在HSA的ⅠB疏水腔中，二者结合力主要为疏水作用和氢键。通过研究体内金属离子对AFG1-HSA反应的影响，Fe3＋、Mg2＋能增大AFG1对HSA的亲和力，而Zn2＋、Cu2＋、Mn2＋离子则能大大降低AFG1与HSA的亲和力。基于Förster’s能量转移，二者反应距离为3.26 nm。3D荧光结果显示，二者的结合反应使HSA生色团氨基酸残基疏水性增加，二级结构发生改变；圆二色谱结果表明，加入AFG1使得HSA的α-螺旋含量增加。

黄曲霉毒素G1；人血清白蛋白；光谱；分子对接；结合反应

钟红, 王佳曼, 马良, 等. 黄曲霉毒素G1与人血清白蛋白的结合机理及分子对接[J]. 食品科学, 2017, 38(5): 86-91.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705014. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Hong, WANG Jiaman, MA Liang, et al. Binding mechanism and molecular docking between aflatoxin G1and human serum albumin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 86-91. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705014. http://www.spkx.net.cn

黄曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）是由黄曲霉（Aspergilus f l avus）和寄生曲霉（Aspergilus parasiticus）产生的主要次级代谢产物之一，主要污染花生、大豆等大宗粮油作物[1-4]。粮油产品产生的黄曲霉毒素中AFG1毒性仅次于AFB1[5]。有研究表明，它比AFB1具有更强的诱发肾脏瘤的潜力，且与肺癌的发生有一定的关联[6-8]。目前黄曲霉毒素经肝脏代谢引起癌症的机理已有很多研究，而在与血清蛋白结合转运到肝脏的毒代动力学鲜少研究[9-11]。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）主要由肝脏产生，它是重要的转运蛋白，能很好地结合很多外源性和内源性物质，并通过对有毒代谢产物的螯合，对机体产生一定的保护作用，同时也会加强该物质的慢性毒作用[12]。黄曲霉毒素经食物进入消化道，50%被排除体外，50%被吸收进入血液和淋巴循环，通过与血清白蛋白形成AFs-HSA复合物转运到人体肝脏，并长期蓄积，通过肝脏代谢活化成强致癌物[13]。

黄曲霉毒素与HSA的反应在其毒代动力学中起着重要的作用。因此研究AFG1与HSA的相互作用对于更深入地了解AFG1的毒理学机制和发展潜在有效解毒剂和预防措施起着重要作用。本实验采用计算模拟和实验分析相结合的方法研究AFG1与HSA的结合模式特性，二者相互佐证、相互补充，为AFG1与HSA反应的毒动力学提供多角度的分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

AFG1标准储备液（固体粉末标品用甲醇配制成浓度为4.0×10－3mol/L）、HSA（分子质量66 000 u，溶于Tris-HCl缓冲液中配制浓度为1.0×10－3mol/L）、Tris美国Sigma-Aldric公司；浓盐酸、甲醇、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化铁、氯化锌、氯化铜、氯化锰 成都市科龙化工试剂厂。

金属离子储存液由Tris-HCl缓冲液配制，pH 7.40、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液含0.10 mol/L NaCl。

1.2 仪器与设备

PHS-25酸度计 杭州雷磁分析仪器厂；UV-2450紫外分光光度计 日本Shimadzu公司；F-4500荧光分光光度计 日本Hitachi公司；MOS-450圆二色谱仪 法国Bio-Logic公司；超纯水系统 美国Milli-Pore公司。

1.3 方法

1.3.1 内滤光的效应的校正

由于AFG1在HSA的激发波长280 nm处有较强吸收，随着AFG1浓度增加，其猝灭行为中存在内滤光效应，需要进行相应的校正。校正方法如下：在1 cm比色皿中加入2.0 mL缓冲液，用微量进样器每次加入一定体积浓度为4.0×10－3mol/L的AFG1溶液，使AFG1浓度分别2.0×10－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、14.0×10－6、16.0×10－6、 18.0×10－6、20.0×10－6mol/L，混匀后，扫描紫外波段为190～400 nm。结果中所用的荧光数据均为校正后的值。按公式（1）对实验中获得的荧光值进行校正[14]：

式中：Fcor为校正后的荧光值；Fobs为校正前的荧光值；Aex为HSA激发波长下相应浓度的AFG1吸收度；Aem为发射波长下相应浓度的AFG1吸收度。

1.3.2 不同温度荧光猝灭和3D荧光的测定

1 cm石英比色皿中加入1.0 mL 2.0×10－6mol/L的HSA溶液，用微量进样器每次加入一定量浓度为4.0×10－3mol/L的A F G1溶液，使A F G1浓度分别2.0×1 0－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、14.0×10－6、16.0×10－6、18.0×10－6、20.0×10－6mol/L，混匀后，在不同的温度条件（298、303、308、313 K）条件下，固定激发波长λex=280 nm，狭缝宽度为5 nm，发射波长在220～500 nm范围内分别扫描HSA的荧光光谱及HSA与AFG1作用后的荧光光谱。

将激发波长扫描范围设置为200～450 nm，发射波长设置为220～600 nm，激发波长每递增5 nm扫描一次谱图，用F-4500荧光分光光度计测定，可分别得到HSA及HSA与AFG1作用后的三维荧光光谱。

1.3.3 圆二色谱测定

配制1.0×10－6mol/L的HSA和HSA-AFG1复合物混合液（HSA浓度为1.0×10－6mol/L；AFG1浓度为1.0×10－5mol/L），单位扫描间隔设置为1 nm，单位扫描时间为2 s，扫描波段为190～250 nm。

1.3.4 AFG1与HSA的分子对接

先以Chemdraw画出AFG1配体的结构简图，（HSA结构从Protein Data Bank（PDB）数据库获取，利用Autodockb 4.0进行分子对接，设置遗传算法计算次数（number of GA runs）设置为10，种群数（population size）设置为150，最大迭代次数（maximum number of evals）设置为25 000 000，其他参数采用默认值。其次是搜索方法采用拉马克遗传算法，最后保存对接参数为dpf文。最后进行分子对接，输出dlg文件。

1.3.5 金属离子对AFG1与HSA结合的影响

在1 cm比色皿中加入1.0 mL浓度为2.0×10－6mol/L的HSA溶液，用微量进样器加入配制好的金属离子储存液1 μL，混匀后扫描荧光光谱，再用进样器每次加入一定量的AFG1标液，使AFG1浓度分别为2.0×10－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、1 4.0×1 0－6、1 6.0×1 0－6、1 8.0×1 0－6、20.0×10－6mol/L，混匀后，在25 ℃条件下，固定激发波长λex=280 nm，狭缝宽度为5 nm，发射波长在220～500 nm范围内扫描荧光光谱。

2 结果与分析

2.1 AFG1与HSA的结合常数、结合位点数研究

AFG1与HSA结合时，HSA荧光强度和AFG1浓度与结合常数和结合位点数的关系满足方程式[15]：

式中：F0和F分别为加入毒素前后的HSA荧光强度；Q0和P0分别为AFG1和HSA的浓度/（mol/L）；K和n分别为结合常数和结合位点数。利用公式，通过（lg（F0－F）/F）对lg{[Q0]－（F0－F）/F0×[P0]}进行线性拟合得到直线的斜率和截距，计算得到AFG1与HSA在不同温度条件下的n和K，线性拟合效果如图1所示：

图 1 不同温度条件下的AFG1-HSA的双对数曲线Fig. 1 Double logarithmic curves of AFG1-HSA binding at different temperatures

通过线性拟合，AFG1-HSA在4 个温度条件下得到的结合位点数n值分别为0.951 8、1.038 8、1.149 5、1.311 4，都约为1，表明一分子的HSA与一分子AFG1结合，且结合过程中只有一个结合位点。通过计算，4 个温度条件下的结合常数K值分别为3.08×104、2.80×104、2.43×104、2.28×104L/mol，K值随着温度的升高而变小，说明反应过程中形成了不稳定的复合物，温度升高，复合物发生分解，进一步说明猝灭机制是静态猝灭[16]。此外，AFG1-HSA在4 个温度条件下K值的数量级都为104，同时温度对结合常数的影响不大，说明AFG1与HSA存在较强的亲和力[17]。毒素分子与HSA的高亲和力结合，不仅会延长毒素在血液中的半衰期，更有利于毒素对器官的定位和形成高剂量的毒素。

2.2 分子对接分析AFG1和HSA结合特性

为了研究AFG1与HSA的结合位点、键合机理和相互作用力，利用Autodock程序进行分子对接研究。HSA由3 个相似的结构域（Ⅰ～Ⅲ）组成：域Ⅰ（1～195）、域Ⅱ（196～383）、域Ⅲ（384～585），每个结构域可以分为A、B两个亚结构域（subdomain），每个亚结构域又分为3 个螺旋（X、Y、Z），以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有的疏水性氨基酸都包埋在圆筒腔内部，构成疏水性腔[18-19]，如图2所示。

图 2 HSA的X-射线晶体结构Fig. 2 X-Ray crystallographic structure of HSA

通过Autodock程序进行HSA与AFG1的分子对接模拟计算，二者在298 K时的Gibbs自由能（Δ G）为－30.646 kJ/mol，最佳对接构象（结合位点为HSA的ⅠB疏水腔）见图3。在ⅠB疏水腔中有两个结合位点：一个位点为L1链、α-螺旋h7和h8之间，为远端位点；另一个位点在L1和α-螺旋h9之间，为近端位点[19]。

图 3 AFG1与HSA的最佳分子对接图Fig. 3 Best molecular modeling for the interaction between AFG1and HSA

图3显示，AFG1整个分子嵌在ⅠB疏水腔的近端结合位点，说明二者主要的作用力为疏水作用。另外还能观察到AFG1的外环酯键的羰基氧与精氨酸（Arg-114）形成了两个氢键，键长为2.2 Å和3.0 Å，同时内环酯键羰基氧与组氨酸（His-146）、桥连五环醚基氧与酪氨酸（Tyr-138）各形成了一个氢键作用，键长分别为2.4 Å和2.0 Å，进一步稳定了AFG1-HSA复合物且增加了AFG1在HSA疏水腔中的疏水性。此外，AFG1双呋喃环上的双键能与附近的氨基酸His-146、Phe-149、Phe-157发生π－π*共轭作用，与呋喃环上没有双键的AFG1相比，AFG1-HSA复合物结构更为稳定，在血液中存在的半衰期时间更长，对人体来说，潜在毒性更大。

此外，有研究表明ⅠB结构域是复杂的杂环分子的主要结合位点[20]。而通过X-晶体衍射研究，含有杂环结构的植物抗癌药物喜树碱也结合在HSA的该疏水腔内[20]。在黄曲霉毒素引起的肝癌治疗中，在手术前后，用喜树碱药物治疗可以增加手术的成活率，这或许不仅跟喜树碱本身的抗癌性有关，还与其能从血清蛋白中置换出黄曲霉毒素，减小黄曲霉毒素与血清蛋白的亲和力，从而增加黄曲霉毒素自由浓度，加强其代谢有关。有赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）动物实验表明，将OTA从血清蛋白中置换出来可以加快消除OTA在靶器官中的积累[21]。因此研究能降低黄曲霉毒素与HSA亲和力的物质，能发展潜在的黄曲霉毒素中毒预防措施。

2.3 金属离子对AFG1与HSA结合反应的影响

在小分子与血清白蛋白相互结合并被转运的过程中，外源或内源金属离子可能会对AFG1-HSA的相互作用过程产生影响。本实验考察了人体内常见的6 种金属离子对AFG1与HSA亲和力的影响，结果见图4。

图 4 金属离子对AFG1-HSA结合常数的影响Fig. 4 Effect of metal ions on the binding constant of AFG1to HSA

由图4可看出，加入Ca2＋对AFG1-HSA的相互作用没有影响，结合常数几乎不变，而Fe3＋、Mg2＋的参与却增大了AFG1对HSA的亲和力，表明这两种金属离子参与降低了AFG1的游离浓度，有助于AFG1分子持久缓释的发挥毒性，增加了个体摄入黄曲霉毒素后患癌症的风险。Zn2＋、Cu2＋、Mn2＋的参与则能大大降低AFG1与HSA的亲和力，具有一定的潜在预防AFG1对人体持久危害的作用，且Zn2＋的效果最好。

2.4 热力学参数和结合力的确定

一般情况下，蛋白质与配体形成超分子复合物主要通过疏水作用、静电作用、范德华力及氢键等来实现[22]。ΔH（焓变）、ΔS（熵变）、ΔG（自由能变化）可通过Van’t Hoff方程进行计算，再根据热力学参数判断AFG1与HSA主要作用力类型。

表 1 不同温度条件下的AFG1-HSA热力学参数Table 1 Thermodynamic parameters of AFG1-HSA system at different temperatures

由表1可知，AFG1与HSA反应的ΔG＜0，说明AFG1与HSA反应过程为自发过程。Ross等[23]通过大量实验结果，得出了通过热力学参数确定蛋白与配体作用力类型的判断依据。结果显示在4 个温度条件下ΔH＜0，说明反应是放热反应。ΔS＞0，说明AFG1与HSA之间存在疏水作用力。由于HSA的复杂结构，在实际与配体的反应中，往往同时存在几种相互作用力[24]，而ΔH＜0，说明反应中还存在一定的氢键作用。通过ΔH和ΔS推断出，AFG1与HSA结合作用力主要是疏水作用力和氢键，且ΔG值、相互作用力类型与分子对接结果一致。在研究AFG1的降毒过程中，增加AFG1的亲水基团，降低其进入HSA疏水腔的概率，可以降低AFG1与HSA的亲和力，从而达到降低AFG1对人体毒性作用的效果。

2.5 AFG1与HSA结合距离的研究

能量转移现象是内源性荧光发色基团发生猝灭，本质上是存在一个分子发射光谱（供体）与另一个分子吸收光谱（受体）重叠，而此时分子之间在偶极-偶极共振耦合作用下使得能量发生转移。根据Förster’s非辐射能量转移，供体和受体之间的距离r与转移效率E、临界距离R0的关系式如下[25]：

式中：F0和F分别是加入供体前后的HSA荧光值；K2为偶极空间取向因子；N是介质折射指数；J为毒素的吸收光谱与蛋白质的荧光发射光谱之间的重叠积分；F（λ）是供体在波长λ时的荧光强度；ε（λ）是毒素在波长λ处的摩尔吸光系数。毒素的紫外光谱与HSA的荧光重叠图谱见图5。在该实验条件下，有报道K2=2/3、N=1.336和Φ=0.118[26]。

图 5 荧光发射光谱与AFG1紫外吸收光谱重叠图Fig. 5 Overlap between fl uorescence emission spectra and absorption spectra of HSA

根据上述公式计算得出，在AFG1-HSA体系中：J= 1.16×10－14（cm3·L）/mol，E=0.17，R0=2.51 nm，r=3.26 nm。数据结果表明AFG1与HSA反应的结合距离r小于7 nm，且同时符合了0.5 R0＜r＜2.0 R0，说明AFG1与HSA在结合过程中发生了非辐射能量转移，导致HSA荧光猝灭，而R0＜r，说明非辐射能量转移引起的荧光猝灭几率较小，静态猝灭占主要地位。

2.6 AFG1与HSA的3D荧光扫描

图 6 HSA与AFG1-HSA的3D荧光谱图和相对应的等高图Fig. 6 Three-dimensional fl uorescence spectra and contour diagrams of HSA and AFG1-HSA

三维荧光光谱体现的是荧光强度随激发和发射波长同时变化的信息，引起谱图特征以及丰富的信息含量，为小分子与生物相互作用机理的研究提供了有力手段[27]。HSA及HSA与AFG1相互作用后的三维荧光及其等高图见图6。

HSA在激发波长为230 nm（峰1）和280 nm（峰2），发射波长为340 nm处分别有一个最大吸收峰。峰1主要显示色氨酸和酪氨酸残基的光谱特性；峰2主要显示多肽链主链结构的荧光特征，是由于多肽骨架结构具有C＝O发生n–π*跃迁引起的，该峰的荧光强度与蛋白质的二级结构密切相关[28]。从图6中的3D荧光的高度及其等高图的疏密程度可以看出，加入AFG1后，HSA的峰1和峰2的荧光强度都呈现明显下降，说明AFG1的加入使得HSA二级结构发生一定的变化。HSA的峰1位置为280 nm/340 nm（λex/λem），峰2位置为235 nm/340 nm；加入AFG1后峰1位置为280 nm/335 nm，峰2位置为235 nm/335 nm，两个峰的stoke位移都发生了约5 nm蓝移，说明AFG1与HSA的结合引起了HSA中部分肽键及其发色荧光基团微环境的疏水性增加，使整个大分子更趋向于折叠状态。

2.6 AFG1与HSA反应的圆二色谱分析

不同二级结构的蛋白质或多肽所产生的CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此CD谱带的π–π*跃迁）和222 nm（肽键的n–π*跃迁）处出现负的吸收峰，α-螺旋结构的含量可用公式（6）、（7）求得[29]：

式中：θobs为208 nm波长处的椭圆度/mdeg；MRE为平均残基的椭圆度/mdeg；Cp为HSA的浓度/（mol/L）；n为氨基酸残基数目（HSA中氨基酸残基数目为585）；l为样品池的光径（0.1 cm）。实验中测定得到了cHSA∶cAFG1=1∶10时体系的CD光谱，结果见图7。

图 7 AFG1与HSA的圆二色谱图Fig. 7 CD Spectra of AFG1and HSA

由图7发现，在AFG1存在的条件下，HSA的208 nm和222 nm处的α-螺旋特征峰显著地体现出来。通过计算，单独HSA的α-螺旋含量为49.27%，加入10 μmol/LAFG1后，HSA的α-螺旋含量增加到60.60%。α-螺旋结构主要是由多肽链上羰基（—CO）和氨基（NH—）之间的氢键稳定[30]。结果说明AFG1与HSA的结合诱导了HSA多肽链的重排，引起原有的氢键网络的结构改变，使得卷曲结构增加，肽链的二级结构发生了较大变化。推断是AFG1与HSA相互作用，使得蛋白质分子的疏水性增强，导致HSA的肽链结构收缩，使得α-螺旋含量增加。说明血清蛋白在运输AFG1的过程中，不仅改变了氨基酸所处的微环境，还使得HSA二级结构发生较大变化，该过程对HSA有一定的毒害作用。

3 结 论

通过研究AFG1与HSA相互作用，可获取AFG1在体内被运转、分配和代谢过程的重要信息。本实验主要运用分子对接及其各种光谱方法，获得AFG1-HSA体系的作用信息。研究发现AFG1能对HSA产生很强的猝灭效果，且猝灭机制为生成复合物的静态猝灭，二者结合常数数量级为104，亲和力较强，且结合位点数约为1。人体内必需的金属离子能够增大或降低AFG1对HSA的亲和力，影响AFG1对人体的毒性行为。通过计算，二者反应距离为

3.26 nm，存在非辐射能量转移。AFG1与HSA的最佳结合位点是HSA的ⅠB疏水腔中，主要结合力是疏水作用和氢键，且二者反应引起了HSA生色团氨基酸残基微环境疏水性增加和二级结构α-螺旋含量增加。该研究对于深入分析小分子毒素在人体内的中毒机理及其暴露的风险评估提供了重要信息，且为发展潜在的中毒预防措施提供基础理论研究。

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Binding Mechanism and Molecular Docking between Af l atoxin G1and Human Serum Albumin

ZHONG Hong, WANG Jiaman, MA Liang*, JIANG Tao
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The interaction between the mycotoxin af l atoxin G1(AFG1) and human serum albumin (HSA) was investigated by molecular docking, f l uorescence spectroscopy, 3D f l uorescence spectrum, and circular dichroism (CD) under simulated physiological conditions (pH 7.4). According to the double logarithmic equation, the major binding mechanism between AFG1and HSA was a static quenching process. At four different temperatures, the magnitude of binding constants was 104and the number of binding sites was approximate to 1. Through the molecular docking and the calculation of thermodynamic parameters, the binding site of AFG1was in the ⅠB hydrophobic cavity, and hydrophobic interaction and hydrogen bonding were the major forces in the binding process. By studying the effect of metal ions on AFG1-HSA reaction, the aff i nity of AFG1to HSA could be increased by Mg2+and Fe3+but greatly reduced by Zn2+, Mn2+and Cu2+. The binding distance between AFG1and HSA was calculated to be 3.26 nm based on Förster’s non-radiation energy transfer theory. The 3D f l orescence spectra revealed that the microenvironment of amino acid residues became more hydrophobic after the binding reaction. CD spectra revealed that the conformation of HSA was changed during the binding reaction as shown by an increase in α-helix. Key words: af l atoxin G1(AFG1); human serum albumin (HSA); spectrum; molecular docking; binding interaction

10.7506/spkx1002-6630-201705014

R994.4

A

2016-09-10

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（2013CB127803）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31301476）

钟红（1991—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：625444055@qq.com

*通信作者：马良（1979—），女，副教授，博士，研究方向为食品安全与食品检测技术。E-mail：zhyhml@163.com