三株产乳酸芽孢杆菌共生培养胞外代谢产物的活性与成分分析

钟日聪++刘影++徐春厚

摘要：对3株产乳酸芽孢杆菌共生培养产生的胞外代谢产物的活性与化学成分进行了初步研究，用杯碟法测定代谢产物的抑菌活性，用气相色谱质谱仪（GC/MS）分析代谢产物的成分。结果表明，3株菌共生培养产生的胞外代谢产物有抑菌活性，对革兰氏阳性菌的抑制作用强；胞外代谢产物中，4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮相对含量最高，为11.16%；其次是开司米酮（5.13%）和烯丙基苯酚（4.02%）；初步确定的抑菌物质为烯丙基苯酚，芳香类物质为4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和开司米酮。

关键词：芽孢杆菌；共生培养；代谢产物；抑菌物质；芳香物质

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）05-0915-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.031

Analyses on the Activity and Composition of Extracellular Metabolites from Symbiotic Culture Liquid of Lactic acid Bacillus Strain SC， SL1 and TR

ZHONG Ri-cong1，LIU Ying2，XU Chun-hou2

（1.Guangdong Guangken Animal Husbandry Co.，Ltd.，Guangzhou 510612，China；

2.Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

Abstract： The antibacterial activity and chemical composition of extracellular metabolites produced by the Lactic acid Bacillus strain SC，SL1 and TR on symbiotic culture were studied using the method of cup dish and gas chromatography-mass spectrometer. The results showed that antibacterial substances existed in the extracellular metabolites produced by three Bacillus on symbiotic culture，it had strong bacteriostatic action to gram positive bacteria. In the extracellular metabolites，the 4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone was the highest in the relative amount，for 11.16%， followed by cashmeran（5.13%） and allylphenol（4.02%）. Allylphenol was preliminary identified as the antibacterial substances，4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone and cashmeran were the aromatic substances.

Key words： Bacillus； symbiotic culture； metabolite； antibacterial substance； aromatic substance

微生態制剂具有调节肠道功能紊乱、抑制病原菌繁殖、维持肠道内菌群平衡、促进机体生长和提高免疫力等作用[1，2]，且能够解决服用抗生素带来的耐药性、二重感染及药物残留等问题，已被广泛用于畜牧、水产养殖及饲料等行业[3-7]。微生态制剂的制备需要益生菌，而产乳酸芽孢杆菌是一类既能产生乳酸又能形成芽孢的革兰阳性杆菌，同时具有乳酸菌和芽孢杆菌的优点，已成为最理想的益生菌之一[8]。芽孢杆菌SC、蜡状芽孢杆菌SL1和芽孢杆菌TR是徐春厚等[9]分离鉴定的益生菌，为了探讨3株产乳酸芽孢杆菌共生培养时的胞外代谢产物的活性及其化学成分，进行了抑菌试验和气相色谱质谱仪（GC/MS）分析，以期为3株益生菌的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

芽孢杆菌SC（Bacillus sp.sc，FJ627944）、蜡状芽孢杆菌SL1（Bacillus cereus SL1，FJ627945）和芽孢杆菌TR（Bacillus sp. TR，FJ627946），3株菌均产生乳酸和形成芽孢，由广东海洋大学预防兽医学实验室分离、鉴定和保存。

1.2 培养基

1.2.1 GYP培养基 蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 发酵培养基 10%黄豆汁100 mL/L，白糖80 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，115 ℃灭菌20 min。

1.3 指示菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia. coli）、鸡白痢沙门菌（Salmonella pullorum）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocide）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），购于中国兽医药品监察所。

1.4 芽孢杆菌共生培养液的制备

用GYP培养基分别活化3株产乳酸芽孢杆菌，按5%接种量和1∶1∶1的接种比例，同时加入的接种顺序，接种到发酵培养基中，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h，再静置培养24 h；将培养物4 000 r/min离心20 min，收集上清液，微孔滤膜过滤，滤液即为3株芽孢杆菌共生培养液；将未接菌的发酵培养基同上处理，即为空白培养液。

1.5 代谢产物的抑菌活性测定

将5种指示菌分别接种到营养肉汤培养基，37 ℃培养12 h，配制成106 CFU/mL的菌悬液，即为指示菌液。采用杯碟法[10]测定芽孢杆菌共生培养液的抑菌活性，用抑菌圈直径的大小表示抑菌活性的高低；同时，用空白培养液同上处理作为对照。

1.6 代谢产物的成分分析

1.6.1 代谢产物的萃取 取3株芽孢杆菌的共生培养液，用二氯甲烷在中性、酸性、碱性条件下萃取，共萃取3次；对照为空白培养液的二氯甲烷萃取物。

1.6.2 GC/MS分析 采用石英毛细管柱DB-5（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），色谱柱程序升温条件：初始温度60 ℃，初始温度保持4 min后，以5 ℃/min的速率升温至300 ℃，并保持5 min；载体：氦气，不分流；柱前压：123.3 kPa；进样口温度310 ℃；EI源电子轰击能：70 eV；离子源温度：320 ℃；扫描质量范围：100～400 AMU；扫描间隔：0.5 s。

2 结果与分析

2.1 代谢产物的抑菌活性测定

3株产乳酸芽孢杆菌共生培养液的抑菌活性测定结果见表1。由表1可知，产乳酸芽孢杆菌共生培养时产生的胞外代谢产物对指示菌均有抑菌效果，其中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰阳性菌的抑制作用强，最大抑菌圈直径可达29.7 mm；对大肠埃希菌等革兰阴性菌的抑菌作用较弱，最小抑菌圈直径仅为11.9 mm。

2.2 空白培养液二氯甲烷萃取物的GC/MS分析

經GC/MS分析得到空白培养液萃取后的化学组分总离子流色谱图（图1），经计算机内存的标准质谱库检索，确定空白培养基萃取物有25种成分，其中相似度在75%以上的有13种（表2），相对含量最高的是4-丁基联苯，为14.12%；其次是邻苯二甲酸二异辛酯和开司米酮，分别为10.93%和9.01%。

2.3 芽孢杆菌共生培养液的GC/MS分析

经GC/MS分析得到3株产乳酸芽孢杆菌共生培养液萃取后的化学组分总离子流色谱图（图2），经计算机内存的标准质谱库检索，确定出3株芽孢杆菌共生培养产生的胞外代谢产物成分有24种，其中相似度在75%以上的有15种（表3），相对含量最高的是开司米酮，为14.14%；其次是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和邻苯二甲酸二异辛酯，分别为11.16%和8.43%。

2.4 共生培养液与空白培养液萃取物的主要成分比较分析

对3株芽孢杆菌共生培养液与空白培养液萃取物进行GC/MS检测，主要成分比较分析结果见表4。由表4可知，3株产乳酸芽孢杆菌共生培养液二氯甲烷萃取物中检测出的相对净含量最高的成分是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮，达到11.16%；其次是开司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、二甲二甲氧基-硅烷（3.62%）、丙基双环己基乙烯（3.53%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-缬氨酸（2.16%）；其中，开司米酮、二甲二甲氧基-硅烷、丙基双环己基乙烯等成分在空白培养液二氯甲烷萃取物中亦检测出来，但含量低于3株菌共生培养液；而4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮、烯丙基苯酚、沙丁胺醇、N-乙酰-L-缬氨酸等成分在空白培养基二氯甲烷萃取物中未检测出来，应该是3株乳酸芽孢杆菌共生培养产生的特有成分。

3 小结与讨论

益生菌能够产生抑菌物质，体外抑菌试验表明，乳酸芽孢杆菌能够抑制大肠埃希菌、沙门氏菌等生长的活性物质[11]。王晓翠等[12]从健康仔猪粪中分离出2株乳酸芽孢杆菌，对大肠杆菌和伤寒沙门氏菌有抑菌作用。本试验结果亦证明了3株产乳酸芽孢杆菌共生培养时，能够产生有抑菌作用的胞外代谢产物，但对革兰阳性菌的抑制作用强，对大肠杆菌等革兰阴性菌抑制作用弱。

3株产乳酸芽孢杆菌共生培养的胞外代谢产物的二氯甲烷萃取物主要化学成分及相对净含量分别为：4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮（11.16%）、开司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-缬氨酸（2.16%）等；其中4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮又名酮麝香或麝香酮，有类似天然麝香香气，香气幻想逼真，用作化妆品香精和季节性用香精的定香剂，在医学上有抗痴呆、抗炎、抗肿瘤等作用[13]；开司米酮具有独特的花香、麝香香气，是一种用途广泛的香料品种，用于配制高档香水和化妆品香精[14]；这表明乳酸芽孢杆菌共生培养后可产生芳香类物质，添加到饲料中可改善饲料的适口性。产生的烯丙基苯酚具有抑菌杀菌作用，目前的研究主要针对植物病原菌如番茄灰霉病菌、苹果腐烂病菌和小麦纹枯病菌有抑制作用[15]。沙丁胺醇具有较强的支气管扩张作用，主要用于平喘药；N-乙酰-L-缬氨酸可用于蛋白质合成，是动物生长和繁殖不可缺少的氨基酸。

通过抑菌试验及GC/MS分析，确定3株乳酸芽孢杆菌共生培养时，可以产生具有抑菌活性和芳香性作用的胞外代谢产物，主要是烯丙基苯酚、4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和开司米酮。为3株乳酸芽孢杆菌的进一步开发应用提供了试验依据。

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