苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵的敏感性基线

刘保友++张伟++栾炳辉++王英姿

摘要：采用菌丝生长速率法测定了苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）对甲基硫菌灵的敏感性。结果显示，EC50处于0.206 7～9.066 5 mg/L之间，平均为3.883 6±2.097 9 mg/L，与甲基硫菌灵对5个野生海棠菌株的EC50平均值3.041 3±0.296 5 mg/L无明显差异。正态检验表明，76个苹果轮纹病菌菌株对甲基硫菌灵的敏感性符合近似正态分布，山东省未出现产生抗药性的苹果轮纹病菌菌株，EC50平均值3.883 6±2.097 9 mg/L可作为苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵的敏感性基线。

关键词：苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）；甲基硫菌灵；敏感性基线

中图分类号：S482.28 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5825-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.024

Sensitivity Baseline of Botryosphaeria dothidea from Apple to Thiophanate-methyl

LIU Bao-you， ZHANG Wei， LUAN Bing-hui， WANG Ying-zi

（Institute of Plant Protection， Yantai Academy of Agricultural Sciences of Shandong Province， Yantai 265500，Shandong， China）

Abstract： Sensitivity in Botryosphaeria dothidea to thiophanate-methyl was determined by mycelium growth rate method in fungicide-amended media. 50% effective concentration（EC50） of thiophanate-methyl were between 0.206 7 mg/L and 9.066 5 mg/L and the mean EC50 was 3.883 6±2.097 9 mg/L. The mean EC50 for 5 white rot isolates of Chinese flowering crabapple without a previous history of fungicide exposure to thiophanate-methyl was 3.041 3±0.296 5 mg/L，which was not distinct from 3.883 6±2.097 9 mg/L. Normal distribution analysis showed that the sensitivity of isolates to thiophanate-methyl was fitted well with a normal distribution function. So far， resistance to thiophanate-methyl was not found in 76 isolates collected in Shandong province. The mean EC50 of 3.883 6±2.097 9 mg/L was made as sensitivity baseline of B. dothidea from apple to thiophanate-methyl.

Key words： Botryosphaeria dothidea； thiophanate-methyl； sensitivity baseline

由蘋果轮纹病菌[Botryosphaeria dothidea（Moug.）Ces.& De Not]引起的苹果轮纹病主要分布于中国、韩国、日本。中国苹果主产区均有不同程度发生，山东各地苹果园普遍发生。该病在山东省具有加重的趋势，严重发病园发病率达40%以上，主要为害果实和枝干，且在果实储藏期仍可发病，危害严重[1]。在防治病害方面，化学杀菌剂仍是当前防治苹果轮纹病的主要手段。甲基硫菌灵为防治苹果轮纹病的重要药剂，该药剂具有保护、治疗、内吸三大功效，因其杀菌谱广、防治效果好而被广泛使用。但由于其作用位点单一，长期连续使用，加速了不同病原菌对甲基硫菌灵的抗药性。据报道，苹果褐斑病菌（Diplocarpon mali）[2]、冬麦雪腐病菌（Gerlachia nivalis）[3]、麦赤霉病菌（Fusarium culmorum）[4]、梨黑星病菌（Venturia nashicola）[5，6]、草坪菌核币斑病菌（Sclerotinia homoeocarpa）[7]、西瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）[8]等病原菌已对甲基硫菌灵产生了抗药性。目前，苹果轮纹病菌已对苯醚甲环唑、氟硅唑[9]、戊唑醇[10]等杀菌剂产生低水平抗药性，但未见有苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵敏感性的研究报道。本研究旨在通过采集山东省不同地区的苹果轮纹病菌，了解苹果轮纹菌株对甲基硫菌灵的抗药性现状，为病害的综合治理提供基本理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2007～2008年分别从山东省济南、烟台、威海、淄博等17个地区苹果园采集典型轮纹病样本300余份。经组织分离、纯化及鉴定，保存菌株272个。挑选76个典型菌株，评价病菌对甲基硫菌灵的敏感性。2009年从未施过甲基硫菌灵的海棠上获取5个野生轮纹菌株，作为参照菌株。

1.2 供试药剂

98%甲基硫菌灵（Thiophanate-methyl）原药，新加坡生达有限公司生产。用少量丙酮溶解后加入0.1%的吐温-80水溶液，配成浓度为10 000 mg/L的母液。

1.3 试验方法

1.3.1 含甲基硫菌灵的PDA培养基 用Eppendorf微量移液器吸取1 mL的甲基硫菌灵母液，用灭菌水配成系列稀释液。将溶化的PDA培养基冷却至40～50 ℃，用微量移液器分别将上述稀释液加入到 49 mL PDA培养基中，配成终浓度分别为50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/L的含药培养基平板。

1.3.2 生长速率法[11] 在PDA培养基上将病原菌培养5 d，自菌落边缘取6 mm的菌饼，用接种针将菌饼接种于含药平板中央，置于26 ℃培养箱中进行培养，5 d后测定菌落生长量。设不含药剂的处理为空白对照，每处理重复3次。

1.4 数据统计与分析

用卡尺准确测量菌落直径（mm），采用十字交叉法垂直测量直径各一次，求其平均值，减去6 mm菌饼直径，即为菌落生长直径。再根据3次重复试验结果，求出各浓度梯度的平均直径，计算不同浓度梯度的菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率=

■×100%

用各浓度梯度对数值及相应的菌丝生长抑制率作回归分析，计算甲基硫菌灵对不同苹果轮纹菌株的EC50、EC90和相关系数，并应用SPSS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

采用菌丝生长速率法测定了76个苹果轮纹菌株对甲基硫菌灵的敏感性。结果表明，甲基硫菌灵对苹果轮纹病菌的菌丝生长具有明显的抑制效果。EC50處于0.206 7～9.066 5 mg/L范围之内，平均为3.883 6±2.097 9 mg/L，EC90平均为25.218 4±11.660 6 mg/L。根据EC50极差R=maxx-minx=9.066 8-0.206 7=8.860 1 mg/L，将处于0～10之间的EC50数据分成10组，具体分组中值、频数见图1。

图1中的曲线代表了苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵的敏感性状况，呈单峰曲线分布；通过K-S正态性检验，得Z=0.523，双侧检验P=0.947>0.05，EC50频数分布表现连续性。结果表明，甲基硫菌灵对76个苹果轮纹菌株的EC50频数分布曲线符合近似正态分布。

为了确定多年来甲基硫菌灵对苹果轮纹病菌的影响，将5个野生海棠轮纹病菌菌株作为参照菌株。结果表明，甲基硫菌灵对其的EC50（表1）与苹果轮纹病菌的EC50（表2）无明显差异。苹果轮纹病菌自然种群中不存在抗药性的菌株，病原菌仍处于原始种群。本研究测定的76个菌株对甲基硫菌灵的EC50平均值为3.883 6±2.097 9 mg/L，可作为苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵的敏感性基线。

3 小结与讨论

甲基硫菌灵自应用于防治苹果轮纹病等多种病害以来，对促进农业的安全生产起到了十分重要的作用。但因其作用位点单一，许多作物病害对甲基硫菌灵已产生了抗药性[2-10]。本研究结果表明，甲基硫菌灵对76个苹果轮纹病菌EC50的频数呈近似正态分布，可将EC50频数分布图及其平均值3.883 6±2.097 9 mg/L作为苹果轮纹病菌对甲基硫菌灵的敏感性基线，为今后田间抗药性菌株的监测提供参考依据。

尽管连续几十年应用甲基硫菌灵防治苹果轮纹病，但未出现敏感性降低的现象。这表明目前该药剂防治苹果轮纹病具有较低的风险性。但这并不意味着苹果轮纹病菌不会对甲基硫菌灵产生抗药性，因此生产上需注意药剂的合理搭配使用。

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[10] 王英姿，张 伟，刘保友，等.山东省苹果轮纹病菌对戊唑醇的抗药性及其地理分布[J].果树学报，2010，27（6）：961-964.

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