石河子地区寄生性杂草菟丝子的种类鉴定

艾尼古丽·依明，付超，郭开发，何丽，赵思峰

(1.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003；2.新疆农垦科学院林园所，新疆石河子 832000)

石河子地区寄生性杂草菟丝子的种类鉴定

艾尼古丽·依明1，付超2，郭开发1，何丽1，赵思峰1

(1.新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院，新疆石河子 832003；2.新疆农垦科学院林园所，新疆石河子 832000)

【目的】明确石河子市及周边植物地区上寄生性杂草菟丝子的种类，为其科学防除、有效监控提供依据。【方法】在石河子市内及其周边不同寄主上采集菟丝子茎、花和成熟、饱满的种子，采用形态学特征观察及ITS、rbcL、trnL-F序列分析对其进行鉴定。【结果】经形态学特征观察结合ITS、rbcL、trnL-F序列分析结果将37份菟丝子样品鉴定为2个种，分别为单柱菟丝子(Cuscutamonogyna)和田野菟丝子(Cuscutacampestris)。【结论】单柱菟丝子和田野菟丝子是新疆石河子地区的主要危害种。

单柱菟丝子；田野菟丝子；形态学特征；分子辅助鉴定

0 引 言

【研究意义】菟丝子属(CuscutaL.)是一年生寄生缠绕草本植物。该属有近200个种[1]，广泛分布于热带和亚热带地区[1]，该属所有种都是我国进境植物检疫性有害生物，其可以寄生于豆科(Leguminosae)、蓼科(Polygonaceae)、菊科(Compositae)、藜科(Chenopodiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、蔷薇科(Rosaceae)等作物、林木及野生杂草上，给农业和园林业生产带来重大损失[2,3]。菟丝子主要以种子扩散，种子小而多，寿命长，在土壤深层的种子能存活5～8年，一旦发生很难根除。新疆是我国菟丝子为害最为严重的地区[3]，目前已报道的种类在10种以上[4,5]，但这些报道均以菟丝子的茎、花、蒴果、种子等形态学特征作为鉴定依据，然而形态特征会受寄主种类、寄主生长状况及环境条件而发生较大变化，从而影响鉴定结果。【前人研究进展】目前对菟丝子的鉴定常用的方法有形态学特征鉴定(依据茎、花、蒴果、种子等形态特征)、细胞学鉴定(依据种皮细胞、染色体细胞数量、核型等信息)和生物化学鉴定(如菟丝子内生物大分子、微量元素、同工酶等)[6,7]，近10年来，ITS、rps2、rbcL序列分析等分子辅助鉴定方法开始广泛应用于菟丝子鉴定及快速检测[1,2]。【本研究切入点】石河子市是国家园林城市，该区域也是北疆重要的农作物种植区，近几年在多种农作物、田间杂草以及林木上均发生了菟丝子为害，且不同寄主上的菟丝子形态特征存在较大差异，但是关于石河子地区菟丝子具体种类至今未见文献报道。研究石河子市及周边植物地区寄生性杂草菟丝子的种类。【拟解决的关键问题】采集石河子市及周边地区菟丝子的花和种子，对其采用形态特征及ITS、rbcL、trnL-F序列分析将其鉴定到种，从而明确石河子地区菟丝子的种类，为确定检疫对象及科学防除方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

从石河子地区石河子市区绿化带、143团、152团、石河子总场农田、石河子市周边平原荒漠杂草上采集37份(从相同环境同种寄主上采集的花和种子算1份)菟丝子的茎、花和饱满、成熟的种子，并将种子置通风处自然风干。从采集的样品中取出有代表性的13份进行形态学观察和测定。列出用于鉴定的菟丝子材料及其来源。表1

表1 试验所用菟丝子材料编号及来源
Table 1 Code and source ofCuscutasamples

编号Samples寄主Host寄主学名Hostscientificname采集地点CollectedsiteSHZ1榆树UlmuspumilaL．石河子市区绿化带SHZ2蜀葵Althaearosea(Linn．)Cavan．石河子总场农田SHZ3顶羽菊Croptilonrepens(L．)DC．石河子市区绿化带SHZ4榆树UlmuspumilaL．152团SHZ5苦豆子SophoraalopecuroidesL．石河子总场农田SHZ6粉苞菊ChondrillajunceaL．石河子市区绿化带SHZ7月季RosachinensisJacq．石河子市区绿化带SHZ8百里香ThymusmongolicusRonn．石河子市区绿化带SHZ9榆树UlmuspumilaL．143团SHZ10赤楠SyzygiumbuxifoliumHook．etArn．石河子市区绿化带SHZ11苦豆子SophoraalopecuroidesL．143团SHZ12刺玫RosadavuricaPall．石河子市区绿化带SHZ13苦豆子SophoraalopecuroidesL．石河子市周边荒漠

1.2 方 法

1.2.1 形态学鉴定

直接或在体视显微镜下，观察藤茎颜色、花序类型、花萼、花冠、雌蕊和雄蕊形状等。在体视显微镜下，观察菟丝子种子表面形状、种皮颜色、质感、种脐形状、晕轮形状等。每份样品精选饱满种子20粒，用十字交叉法测量种子大小，记录数据最大值和最小值。参考马德英、庄蓉、黄健中、Costea、Yuncker[5-9]等报道的菟丝子的分类特征进行鉴定。

1.2.2 分子鉴定

1.2.2.1 DNA提取

从13份菟丝子种子样品中各取20粒，用10%的次氯酸钠处理5 min，蒸馏水冲洗3次。采用NuCleanPlantGen DNA Kit提取试剂盒(CW0531)提取DNA，操作步骤根据其使用说明书。

1.2.2.2 ITS、rbcL、trnL-F序列的 PCR 扩增

PCR 反应体系： PCRTaqMix 12.5 μL、 10 μmol/L ITS5/ C/rbcL-f 1 μL、 10 μmol/L ITS4/ F/rbcL-r 1 μL、基因组 DNA 0.5 μL、 ddH2O 10 μL 至终体积为 25 μL。

采用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3')扩增nrDNA-ITS 的ITS1、5.8S和ITS2区[10]。扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，30次循环；最后 72 ℃延伸 10 min。采用引物rbcL-f(5'-TCACCACAAACAGAGACTAA-3')和rbcL-r(5'-TCTTCACATGTACCTGCAGT-3')扩增rbcL基因[2]。扩增反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 次循环；最后72 ℃延伸10 min。采用引物C(5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3')和 F(5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3')扩增ptDNA的trnL内含子、3'trnL外显子及其与trnF间片段(统称trnL-F片段)[11]。扩增反应程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸 40 s，30 次循环；最后72 ℃延伸 10 min。反应完成后，12 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应产物。

1.2.2.3 ITS、rbcL、trnL-F序列分析及系统发育树构建

将不同引物PCR 反应产物进一步纯化后，送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因测序。将测定获得的 ITS、rbcL、trnL-F序列在GenBank中用BLASTn程序分别下载同源序列。使用 MEGA 5 软件，对序列进行比对( alignment)，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，通过自举( bootstrap)对系统发育树进行检验，1 000 次重复。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

经形态学观察，发现样品代号SHZ 2、SHZ 3、SHZ 6、SHZ 8和SHZ 13样品的茎较细(直径0.3～0.8 mm)，黄色至橘黄色，花白色，花长2～4 mm，具腺体，有短花梗，聚集成头状的团伞花序。花萼包藏花冠筒，裂片卵形或近圆形，或宽大于长。花冠裂片宽三角状，锐尖，尖端常向内弯折，约与短而钟形的花冠筒等长。雄蕊短于裂片，花药椭圆形，花丝比花药长或与之等长。鳞片卵形，边缘流苏状。子房球形。通常花柱2，极少数花柱3，纤细，约等长于子房，柱头头状。蒴果不开裂。种子卵圆形，近三面体，红褐色至黄褐色，长1.2～1.5 mm，宽1.0～1.3 mm，背面圆拱，腹面被隆起的中脊分成两个平面，表面粗糙，密布细颗粒。晕轮较大，近圆形，脐沟宽或狭窄，脐线呈线性或波浪线，淡黄色。有明显的喙状突起。这5个样品完全符合田野菟丝子(C.campestris)鉴别特征(图1A，图2：1～3，图3A)。

代号为SHZ 1、SHZ 4、SHZ 5、SHZ 7、SHZ 9、SHZ 10、SHZ 11和SHZ 12的样品茎粗糙(直径1～3 mm)，淡青色至微红色并有紫色瘤状突起。花玫红色或几白色，花长3～4 mm，总花无梗或梗短，穗状花序松散或穗状圆锥花序。花萼包藏花冠筒，裂片近半圆形，重叠，有紫色龙骨状突起。花冠裂片卵圆形，顶端钝，坛状直立，表面常具颗粒，裂片裂至圆筒的一半。鳞片齿状，基部相连，并贴生在花冠上，顶端平截或成二裂式。花药无柄，着生在花冠的喉部。子房球形。花柱1，短，近与柱头直径等长，柱头头状，中央有浅裂缝。种子椭圆形或舌尖状，灰白色至棕褐色，长2.3～3.4 mm，宽1.4～2.6 mm。背面平或微凹，腹面平或由隆起的中脊分成两平面，表面具条纹状纹饰，条纹间有细小的颗粒状突起。晕轮长椭圆形，晕轮表面有裂纹或无裂纹，种脐下陷或与晕轮面平齐或衣领状突起，种脐线性或微带弧度，褐色，有明显的喙状突起。这8个样品完全符合单柱菟丝子(C.monogyna)鉴别特征(图1B，图2：4～8，图3B)。图1～3

对参试的采自石河子地区不同生境和寄主的13个菟丝子样品根据茎、花和种子的形态学特征，共鉴定出两个种：田野菟丝子(Cuscutacampestris)和单柱菟丝子(Cuscutamonogyna)。

注：A,田野菟丝子；B单柱菟丝子

Note: A,C.campestris; B,C.monogyna

图1 菟丝子种子形态特征

Fig.1 Seeds morphologic characteristic ofCuscuta

注：1～3，田野菟丝子；4～8，单柱菟丝子

Note: 1-3,C.campestris; 4-8,C.monogyna

图2 菟丝子种脐的形态特征
Fig.2 Umbilici morphologic characteristic ofCuscuta

注：A：田野菟丝子，a：花萼，b：展开的花冠，c：雌蕊；B：单柱菟丝子，a：花萼，b：展开的花冠，c：雌蕊

Note: A:C.campestris, a: calyx, b: expended corolla, c: pistil;B:C.monogyna, a: calyx, b: expended corolla, c: pistil

图3 菟丝子花的显微镜观察结果
Fig.3 Flower morphologic characteristic ofCuscuta

2.2 分子辅助鉴定

利用 ITS 和rbcL两个序列分别对菟丝子样品进行 PCR 扩增，并经电泳检测获得大小分别为 600 bp和700 bp的清晰条带(图4，图5)。trnL-F序列分别扩增出的片段长度分别为500 bp和800 bp的条带(图6)。将PCR样品纯化测序后将测序结果提交到GenBank，获得ITS序列登录号为KX456192-KX456204。rbcL、trnL-F序列已提交，还未给登录号。图4～6

注：M: Marker(200 bp)；泳道 2、3、6、8、13 为田野菟丝子；泳道1、4、5、7、9、10、11、12 为单柱菟丝子

Note: M: Marker(200 bp)；2、3、6、8、13：C.campestris；1、4、5、7、9、10、11、12：C.monogyna

图4 菟丝子种子样品ITS序列PCR扩增结果
Fig.4 PCR products of ITS ofCuscutaspp. samples

图5 菟丝子种子样品rbcL序列PCR扩增结果
Fig.5 PCR products ofrbcLofCuscutaspp. samples

图6 菟丝子种子样品trnL-F序列PCR扩增结果
Fig.6 PCR products oftrnL-FofCuscutaspp. samples

用MEGA 5 软件将13个菟丝子样品的ITS ，rbcL和trnL-F序列分别与从GenBank数据库中下载的同源序列进行比对并构建系统发育树。结果显示，ITS序列测定产物SHZ1、SHZ4、SHZ5、SHZ7、SHZ9、SHZ10、SHZ11、SHZ12与已登录的C.monogyna(DQ924569)序列相似率达99%。 SHZ2、SHZ3、SHZ6、SHZ8、SHZ13与已登录的C.campestris(KT383104)序列相似率达99%；rbcL序列测定结果显示，SHZ1、SHZ 4、SHZ5、SHZ7、SHZ9、SHZ10、SHZ11、SHZ12与已登录的C.monogyna(KJ436686)序列相似率达100%。SHZ2、SHZ3、SHZ6、SHZ8、SHZ13与已登录的C.campestris(EU883476)序列相似率达100%；trnL-F序列测定结果显示，SHZ1、SHZ4、SHZ5、SHZ7、SHZ9、SHZ10、SHZ11、SHZ12与已登录的C.monogyna(AJ428054)序列相似率达99%。SHZ2、SHZ3、SHZ6、SHZ8、SHZ1与已登录的C.campestris(KJ371719)序列相似率达99%。ITS ，rbcL和trnL-F序列分析结果表明，SHZ1、SHZ4、SHZ5、SHZ7、SHZ9、SHZ10、SHZ11、SHZ12为C.monogyna，SHZ2、SHZ3、SHZ6、SHZ8、SHZ13为C.campestris，分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。图7～9

图7 基于ITS序列构建的系统发育树
Fig.7 Phylogenetic tree based onalignment of ITS sequences data ofCuscutasamples

图8 基于rbc-L序列构建的系统发育树
Fig.8 Phylogenetic tree based onalignment ofrbc-Lsequences data ofCuscutasamples

图9 基于trnL-F序列构建的系统发育树
Fig.9 Phylogenetic tree based onalignment oftrnL-Fsequences data ofCuscutasamples.

3 讨 论

菟丝子属有近200个种，该属植物由于适应区域广，可寄生农作物、园林绿化植物、生态林、牧草以及田间杂草等，且寄生后可对这些植物造成毁灭性的影响，因此该属所有种均被列入我国的外检和内检对象。目前新疆是我国报道菟丝子种类最多、危害最为严重的地区，其中阴知勤[4]报道在新疆存在11种菟丝子，并对每一种菟丝子的形态特征及在新疆的分布进行了描述；马德英等[5]报道了新疆8种菟丝子的种子特征；蔡磊明等[3]认为田野菟丝子是新疆伊犁地区的主要种，其可以寄生30科、81属、113种寄主，其对苜蓿的危害占种植面积的90%以上。文献报道均是基于菟丝子茎、花和种子特征得出的结论，而黄健中等[7]、Jayasuriya等[12,13]均发现菟丝子种子形态特征不同种之间有一定区别，但种子的吸涨情况、休眠情况均会影响种脐形态、宽度等重要特征从而影响鉴定结果；廖咏梅等[15]发现日本菟丝子种内不同个体间茎的颜色存在一定差异。研究也观察发现，田野菟丝子和单柱菟丝子两个种的茎、花、种子的形态特征都存在明显的差异。在同一个种不同样品之间，田野菟丝子不同样品的茎和花形态特征差异不明显，但种脐形态、脐沟宽窄等特征存在较大差异。单柱菟丝子不同样品间茎的粗细、颜色，花的大小、颜色等均存在明显差异；种子晕轮表面无裂纹，但部分种子晕轮表面有裂纹，种脐形状也有明显差异。由此可见仅采用形态学鉴定特征鉴定菟丝子的种，很可能出现鉴定结果不准确的情况，采用分子辅助鉴定能够很好地验证形态学鉴定结果的准确性[1,2,15]。

阴知勤[4]报道在石河子存在菟丝子(C.chinensisL)和单柱菟丝子(C.monogyna)两个种，在石河子市周边玛纳斯县还有欧洲菟丝子(C.europaea)、恩氏菟丝子(C.engelmanii)等。研究采用形态学特征结合分子辅助鉴定手段将从石河子地区采集的37份菟丝子样品鉴定为田野菟丝子C.campestris和单柱菟丝子2个种，该研究结果与阴知勤的结果有一定差异，可能是因为菟丝子和田野菟丝子在形态特征上非常相似[16]。

4 结 论

经形态学特征观察结合ITS、rbcL、trnL-F序列分析结果将37份菟丝子样品鉴定为2个种，分别为单柱菟丝子(Cuscutamonogyna)和田野菟丝子(Cuscutacampestris)。单柱菟丝子和田野菟丝子是新疆石河子地区的主要危害种。

此次研究菟丝子样品采集数量还有不足，在今后的研究中还需要进一步扩大采样范围，增加采样数量，准确地确定石河子地区菟丝子种类及其分布范围。

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Supported by:Science and Technology Aid Project of the Xinjiang Production and Construction Group"Research and demonstration of pepper main pest integrated control technique"(2014AB019)

Species Identification of Parasitic WeedCuscutain Shihezi Area

Aynigul Yiming1，FU Chao2，GUO Kai-fa1，HE Li1，ZHAO Si-feng1

(1.KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion/CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China; 2.ForestandHorticultureResearchInstitute,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences,ShiheziXinjiang832000,China)

【Objective】 In order to identify the species ofCuscutain Shihezi area and its surroundings in the hope of providing the basis for scientific control and monitoring ofCuscuta.【Method】Stems, flowers and mature, plump seeds ofCuscutawere collected from different host species in Shihezi area and its surrounding and morphology characteristics and ITS,rbcL,trnL-Fgenesequences were used to identifyCuscuta.【Result】A total of 37 samples ofCuscutawere identified as twoCuscutaspecies,CuscutacampestrisandCuscutamonogynabased on the result of morphology and ITS,rbcL,trnL-Fgenesequences analysis.【Conclusion】The mainCuscutaspecies in Shihezi areCuscutacampestrisandCuscutamonogyna.

Cuscutamonogyna;Cuscutacampestris; morphology characteristics；molecular assisted identification

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.016

2016-11-11

新疆生产建设兵团科技支疆课题“辣椒主要病虫害综合防治技术研究与示范”(2014AB019)

艾尼古丽·依明(1991-)，女，新疆温宿人，硕士研究生，研究方向为植物病害生物防治，(E-mail)1106706358@qq.com

赵思峰(1975-)，男，四川巴中人，教授，博士，博士生导师，研究方向为植物病害生物防治，(E-mail)zhsf_agr@shzu.edu.cn

S451

A

1001-4330(2017)02-0327-09