hERG钾通道通过降低氧化应激改善肝细胞糖代谢

卢 晶 沈 涵 程 呈 宋丽妮 张怡尘 谢荣荣 袁明霞 杨金奎*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重点实验室,北京 100730)

·内分泌与代谢病专题 ·

hERG钾通道通过降低氧化应激改善肝细胞糖代谢

卢 晶1，2沈 涵1，2程 呈1，2宋丽妮1，2张怡尘1，2谢荣荣1，2袁明霞1，2杨金奎1，2*

(1.首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重点实验室,北京 100730)

目的 研究hERG钾通道(human ether-α-go-go related gene channels) 在肝细胞中与糖代谢的关系。方法 用hERG钾通道过表达载体转染人类肝癌细胞系(liver hepatocellular carcinoma, HepG2)细胞，通过荧光定量PCR (real-time PCR, RT-PCR) 和蛋白印迹 (Western blotting) 法检测糖代谢、糖异生、氧化应激及还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate, NADPH ) 相关亚基的表达。结果hERG钾通道蛋白可在肝脏细胞中表达，将hERG钾通道过表达于HepG2细胞后，糖异生相关基因葡萄糖-6-磷酸激酶 (glucose-6-phosphatase, G6Pase) 表达显著降低，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK) 表达有降低。胰岛素表达相关基因葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter type 2, GLUT2)、胰岛素受体底物2 (insulin receptor substrate, IRS-2) 和腺苷酸活化蛋白激酶α亚基2 [(adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase), AMPKα2] 的表达水平均显著增高。NADPH4种亚基p22、p47、p67和p91表达均显著降低。结论hERG钾通道可以通过降低氧化应激改善肝细胞内糖代谢。

人ether-α-go-go相关基因;胰岛素抵抗；氧化应激；糖代谢

流行病学研究表明，糖尿病在我国发病人数接近1亿，严重影响我国人民健康状况。2型糖尿病主要表现为胰岛素分泌缺陷或胰岛素分泌障碍[1-2]。肝脏是机体能量代谢的主要器官之一，也是胰岛素作用的主要靶器官，参与维持体内空腹血糖浓度。肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出能力，造成糖异生增加，糖原分解减少，从而导致2型糖尿病。

人ether-a-go-go相关基因 (human ether-a-go-go related gene,hERG) 编码的离子通道称为hERG钾通道，属于电压依赖性钾通道(voltage-dependent potassium channel, Kv) 家族成员[3]。hERG钾通道主要参与心肌动作电位的复极化，hERG钾通道突变后可导致外向复极钾电流降低，QT间隙延长，引起多型性室性心动过速，严重者可导致猝死，即长QT综合征 (long-QT syndrome, LQTs)[4]。 本课题组[5]前期已成功构建hERG钾通道基因敲除小鼠，并发现hERG钾通道基因在维持胰岛β细胞的形态及功能方面具有重要作用，敲除小鼠表现为血糖水平增高和胰岛素分泌降低。氧化应激是造成胰岛素抵抗的重要原因之一，hERG钾通道可能通过抑制氧化应激来改善机体内糖代谢。

本研究拟在细胞水平研究hERG钾通道在人肝脏细胞HepG2中的表达情况，并深入研究其与氧化应激和糖代谢的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肝癌细胞系HepG2购自中国协和医科大学细胞资源中心 (Cell Resource Center, IBMS, CAMS/PUMC)，用DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco公司，美国)进行培养，加入10%(体积分数)胎牛血清(Gibco公司，美国)、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素(Gibco公司，美国)，放于37 ℃，5%(体积分数) CO2孵箱内培养，每2 d用0.25%(质量分数)胰酶(Gibco公司，美国)消化后传代，待细胞生长至90%时进行质粒转染。

1.2 质粒构建和转染

将hERG钾通道基因构建到pcDNA3.1-GFP-His(-)B (PCDB) (Sino-Geno Max, 中国) 载体上。质粒DNA采用TransIntro EL Transfection Reagent(TransGen Biotech 公司，中国)脂质体转染法，根据转染试剂盒操作说明转染HepG2 细胞。以pcDNA3.1-增强型绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP) 载体转染的HepG2 细胞作为实验对照组(control)。细胞转染48 h后观察GFP荧光强度并收集细胞用于后续实验。

1.3 RNA的提取和荧光实时定量PCR

采用天根细胞组织总RNA提取试剂盒(批号：DP419)提取RNA，采用天根FastQuant cDNA第一链合成预混试剂(批号：KR108)合成cDNA。Beta-actin基因作为内参。采用Light Cycler 96仪器 (Roche公司，美国)，SYBR Green master mix检测RNA的表达情况。PCR反应体系为20μL，2×Enzyme mix (Transgen Biotech, 批号：AS111) 10 μL；正向引物 0.4 μL；反向引物 0.4 μL； cDNA 1.5μL， DEPC H2O 7.7 μL。扩增条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35个循环；72 ℃ 5 min，自然冷却至室温，所用引物见表1。

表1 引物序列

1.4 Western blotting分析

采用BCA蛋白分析试剂盒 (碧云天生物技术有限公司，中国)测定蛋白浓度。hERG抗体购自Sigma公司(美国)，批号SAB14082；PEPCK购自Santa-Cruz公司(美国)，批号SC-28477；G6Pase购自Santa-Cruz公司(美国)，批号SC-25486；Beta-actin作为内参，抗体购自CST(Cell Signal Technology)公司，批号8457。取80 μg总蛋白进行10%(质量分数)的SDS-PAGE电泳，湿转(200 mA，120 min)至硝酸纤维膜上。用TBST[TBS+0.1%(体积分数) Tween-20]配制的5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭1.5 h，用封闭液将一抗稀释后与膜在4 ℃摇床孵育过夜，次日用TBST洗膜3次，每次5 min，再与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的二抗(1∶2 000)室温孵育1 h。TBST洗涤，滴加增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)发光液后用Chemi-Doc Touch凝胶成像系统显影成像，并用Image J软件对图像进行灰度分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1hERG载体转染HepG2细胞

将hERG过表达质粒和pcDNA3.1-GFP质粒分别转染HepG2细胞，48 h后观察GFP表达情况。结果显示，两种质粒的GFP荧光均有明显表达，两种质粒均成功转染HepG2细胞(图1)。

2.2hERG钾通道在肝脏细胞中表达

采用Western blotting法检测hERG蛋白在人肝脏细胞HepG2中的表达。结果显示，hERG蛋白在HepG2中有表达，而将hERG钾通道蛋白过表达HepG2后，hERG蛋白表达增加明显 (P<0.01，图2)。

2.3hERG钾通道对糖异生相关基因的影响

将hERG钾通道过表达于HepG2细胞后，检测糖异生相关基因PEPCK和G6Pase蛋白的表达。Western blotting结果显示，hERG钾通道过表达HepG2细胞后，G6Pase蛋白水平显著降低 (P<0.05)。PEPCK表达水平降低(图3)。

图1 质粒转染HepG2

A：hERGover-expression plasmid； B： pcDNA3. 1-GFP vector；hERG: human ether-a-go-go related gene； Bar: 100 μm.

图2 hERG钾通道蛋白在HepG2细胞中的表达

图3 hERG钾通道对HepG2细胞糖异生相关基因表达的影响

*P<0.05vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene;G6Pase: glucose-6-phosphatase;PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase.

2.4hERG钾通道对糖代谢相关基因表达的影响

将hERG钾通道过表达于HepG2细胞后，采用RT-PCR方法检测糖代谢相关基因GLUT2、IRS-2和AMPKα2的表达水平，结果显示，hERG钾通道过表达HepG2细胞后，与对照组相比，3种基因的mRNA水平显著升高 (P<0.05)(图4)。

图4 hERG钾通道对HepG2细胞糖代谢相关基因表达的影响

*P<0.05,***P=0.000vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene;GLUT2:glucose transporter type 2;IRS-2: insulin receptor substrate-2;AMPKα2: adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase α2.

2.4hERG过表达降低NADPH相关亚基的表达水平

为检测hERG过表达后对NADPH亚基的影响，采用RT-PCR检测NADPH亚基p22、p47、p67和p91的mRNA表达，结果显示，hERG过表达后p22、p47、p67和p91的mRNA表达均明显降低(P<0.05，图5)。

3 讨论

hERG钾通道属于电压依赖性钾通道家族，但是其电流特点与其他传统的钾通道不同，较为复杂[6]。hERG钾通道在多种组织，如心、脑、垂体、胰腺等均有表达，并发挥不同作用[7]。本课题组[8]前期研究显示，在C57BL/6小鼠上将hERG基因敲除后，小鼠会出现血糖增高、胰岛素抵抗等糖代谢紊乱症状现象。肝脏是体内糖代谢的重要器官之一。胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的机制之一。氧化应激是造成胰岛素抵抗的重要原因。目前尚未有研究hERG钾通道与氧化应激及糖代谢的关系的报道。本研究在细胞水平证实，hERG钾通道在肝脏细胞中表达，并通过降低氧化应激，减少糖异生，改善糖代谢。

图5 hERG降低HepG2细胞中NADPH亚基的表达

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group,n=3；hERG: human ether-a-go-go related gene; NADPH: nicotinamide adenine dinucleotide 2′-phosphate.

AMPK是一个能量传感器，参与调节包括胰岛B细胞、肝脏、骨骼肌和脂肪在内的多种外周组织的糖脂代谢过程[9]。AMPK是一个异源三聚体蛋白，由α、β和γ 3个亚单位组成，其中α亚基起催化作用。AMPK的亚基α2的活性与胰岛素抵抗相关[10-11]。本研究结果显示，hERG可诱导AMPKα2的表达。糖代谢相关基因GLUT2和IRS-2表达也增高，PEPCK和G6Pase是糖异生的主要限速酶，hERG过表达后，糖异生基因PEPCK和G6Pase表达下降，提示hERG钾通道在细胞水平可以降低糖异生，促进糖分解。

NADPH氧化酶属于NOX家族成员，主要由催化亚基p91，跨膜亚基p22，胞质亚基p47、p67等组成的酶复合体。NADPH氧化酶主要的生理学功能是产生ROS，参与机体氧化应激，已有研究[12-13]表明其与胰岛素抵抗密切相关。因此本研究推测，hERG钾通道可能通过抑制氧化应激作用，减少胰岛素抵抗从而改善糖代谢。本研究结果证实了这一推测，hERG过表达后，NADPH 4种亚基均有明显降低，显示hERG钾通道通过降低氧化应激水平，调节糖代谢。

本研究下一步拟在两方面进行深入研究。一方面，在动物水平，利用课题组前期构建的hERG敲除小鼠，研究hERG钾通道敲除后，主要是肝脏内，氧化应激是否增加从而导致糖耐量异常；另一方面，目前已知的多种hERG钾通道抑制剂，如E4031[14]、多菲利特[15]、西沙比利[3,16]、维拉帕米[17]等，这几种药物均在不同程度上影响hERG钾通道的门控特性，使其改变，造成电流幅度下降甚至完全消失。本课题组将在细胞水平和动物水平分别运用这几种药物，研究药物抑制后hERG钾通道对氧化应激及糖代谢的影响。

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编辑 慕 萌

Human ether-α-go-go related gene channels improves glucose metabolism via anti-oxidative stress in HepG2 cells

Lu Jing1，2, Sheng Han1，2, Cheng Cheng1，2, Song Lini1，2, Zhang Yichen1，2, Xie Rongrong1，2, Yuan Mingxia1，2, Yang Jinkui1，2*

(1.DepartmentofEndocrinology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofDiabetesResearchandCare,Beijing100730,China)

Objective To evaluate the effect of the new pathway of human ether-α-go-go related gene (hERG) channels on glucose metabolism in hepatic cells. Methods Liver hepatocellular carcinoma (HepG2) cells were transfected withhERGchannels over-expression plasmid DNA. pcDNA3. 1-GFP plasmid was used as a negative control. The expression ofhERG, phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) were detected by Western blotting. The mRNA level of glucose transporter type 2 (GLUT2), insulin receptor substrate (IRS-2), adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase (AMPKα2), p22, p47, p67 and p91 were observed by real-time PCR(RT-PCR). Results The experiments showed that hERG gene can be expressed in HepG2 cells. Over-expression ofhERGgene in HepG2 cells could down-regulate the expression of PEPCK, G6Pase. while GLUT2, IRS-2, AMPKα2 genes were up-regulated. Over-expression of hERG gene also inhibited the relative mRNA level of p22, p47, p67and p91. ConclusionhERGchannels could be involved in improving glucose metabolism via anti-oxidative effects.

human ether-α-go-go related gene channels; insulin resistance; oxidative stress; glucose metabolism

国家自然科学基金(81370946, 81400824, 81300726)，北京市自然科学基金(7131005)，首都医科大学附属北京同仁医院科研基金 (TRYY-KYJJ-2016-013)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81370946, 81400824, 81300726), Natural Science Foundation of Beijing (7131005) ， Foundation of Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University (TRYY-KYJJ-2016-013).

时间：2017-04-13 20∶07

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2007.058.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.003]

R587.1

2017-01-20)

*Corresponding author， E-mail：jinkui.yang@gmail.com