新疆特色食品中优良乳酸菌的筛选及分离鉴定

杨玉新，韦鹏，李丹，杨婕，宋振*

（新疆中亚食品研发中心有限公司，新疆乌鲁木齐830000）

新疆特色食品中优良乳酸菌的筛选及分离鉴定

杨玉新，韦鹏，李丹，杨婕，宋振*

（新疆中亚食品研发中心有限公司，新疆乌鲁木齐830000）

该研究利用传统培养法从自然发酵的新疆特色食品中分离筛选出3株菌，通过菌株形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定。结果表明，菌株L-6、L-7和L-8分别被鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）及短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。产酸试验结果表明，这3株菌均具有较强的产酸能力，发酵12 h后发酵液pH值可达4.0以下，其中菌株L-7产酸能力最强，在15 h后其发酵液pH值在3.5以下，可用于辣椒酱或其他发酵食品发酵剂的研制。

新疆特色制品；乳酸菌；筛选；鉴定

乳酸菌是人类和动物胃肠道内的优势菌群，在机体的正常代谢与健康状态的保持方面发挥着很大的作用，因其良好的益生性能在乳制品加工、发酵果蔬加工、酿造工业等领域得到广泛应用[1-3]。乳酸菌除了具有良好的益生性外，还具有优良的发酵性能[4]，筛选优良乳酸菌，并进行发酵剂研究与开发，为世界各国所重视[5]。

新疆有着丰富的传统发酵食品资源，如骆驼酸乳、马奶、奶酪、自然发酵辣椒酱等独特的民族特色传统发酵制品，这些制品中含有丰富的乳酸菌[6]。采用纯种菌株定向发酵替代自然发酵，能够有效控制风味品质的稳定性[7]，缩短发酵时间，从而实现以辣椒酱为代表的发酵果蔬工业化、规模化、标准化发展。

新疆传统的辣椒酱多采用自然发酵方式生产，自然发酵的菌种繁杂，其中的微生物存在复杂的互生、共生、拮抗等关系，在发酵过程中协调作用产生丰富的有益物质，但由于自然发酵时间长，发酵过程难控制[5]，导致生产过程中劳动强度大，卫生条件差，自动化水平低，产品质量不稳定，生产效率低。

本研究以新疆少数民族的传统食品为研究对象，采用菌株形态学、生理生化试验及16S rDNA序列分析相结合的方法[8]对分离出的产酸能力强的优良乳酸菌进行鉴定，以期为乳酸菌在发酵辣椒酱中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骆驼酸乳、马奶、自然发酵辣椒酱：新疆乌鲁木齐南山农牧民家；MRS培养基、MRS肉汤培养基、革兰氏染色试剂盒：北京陆桥技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒：美国OMEGA公司；TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）、DL2000Marker：天为时代生物有限公司；碳酸钙（CaCO3）：西安裕华生物科技有限公司；过氧化氢：天津市科密欧化学试剂有限公司；其他化学药品均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

OlympusBH-2光学显微镜：奥林巴斯有限公司；FE20pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-7200紫外分光光度计：尤尼科（上海）仪器有限公司；T-Gradient温度梯度聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Biometra公司；BHG-8082型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离纯化

取骆驼酸乳、马奶和辣椒酱样品各25 g于225 mL无菌生理盐水中，充分混匀后，梯度稀释成10-1、……、10-6浓度的样液，分别取不同梯度稀释样液100μL涂布于含有2%CaCO3MRS培养基上，37℃培养48 h。挑取单个、生长较快、有溶钙圈的菌落，接种于MRS培养基中，重复分离纯化6次[9]，取纯化后典型菌落进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验[10]，并进行油镜镜检，取革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株接种于MRS肉汤培养基中37℃培养24 h，将菌株进行编号，转接到甘油管中-80℃保存。

1.3.2 菌株形态学鉴定

挑取纯化后的菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶接触试验。革兰氏染色阳性且过氧化氢酶阴性者初步判断为乳酸菌[11]，观察菌落形态，通过革兰氏染色镜检图片记录记录菌落大小、颜色、凹凸等情况，在光学显微镜观察菌体形态特征。

1.3.3 菌种产酸量的测定

将分离菌株按5%的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37℃、3 000 r/min摇床培养，每隔3 h检测一次各菌株发酵液的pH值，以培养时间为横坐标，菌株发酵液pH值为纵坐标绘制产酸速率曲线[12]。

1.3.4 生理生化特性鉴定

分离菌株的硝酸盐还原、吲哚、精氨酸水解、葡萄糖产酸、明胶液化等生理生化试验均参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]中的方法进行鉴定。

1.3.5 菌株的16S rDNA序列分析

使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。16S rDNA扩增引物采用细菌通用引物：正向引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物为5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR扩增体系为：10×Buffer 0.5μL，正向引物2μL，反向引物2μL，模板4μL，三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）MIX 2 μL，聚合酶0.3 μL，补充去离子水至50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸50s，33个循环，72℃延伸17 min。PCR产物的核苷酸序列测定按试剂盒说明书进行。扩增反应完毕后，取PCR产物与6×Loading Buffer混合加样，1.0%的琼脂糖凝胶点样孔中，上机电泳，电泳液为0.5×TBE，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色30 min，电泳结束后将胶板置于凝胶成像系统中观察。若PCR扩增成功，则会在1 500 bp处见到条带并拍照。

系统发育树构建[14]：将得到PCR产物交由中国食品发酵工业研究院进行测序，测序结果在GenBank数据库中进行比对分析，以确定其与模式菌种的同源关系。确定并下载各模式菌种的有效序列后，采用ClustalX1.83进行多序列比对后，使用MEGA 5.0软件中的邻接法（Neighbor-joining）进行系统发育分析，进行1 000次的相似度重复计算，发育树节点只显示Bootstrap值＞50%数值。

2 结果与分析

2.1 新疆特色食品中乳酸菌的筛选及产酸速率的测定

从骆驼酸乳、马奶、辣椒酱样品中共分离出9株乳酸菌，其革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性，符合乳酸菌的特征。从MRS培养基上挑取9个有溶钙圈且外观不同的菌落，分别命名为菌株L-1～L-9。

产酸速率与产酸量是筛选优良乳酸菌的重要指标，本试验对新疆自然发酵食品中筛选出的乳酸菌的产酸特性进行研究，9株分离菌株产酸速率曲线如图1所示。

图19 株菌产酸速率曲线Fig.1 Acid-producing speed curves of nine strains

由图1可知，随着发酵时间的延长，9株菌发酵液的pH值均呈逐渐下降趋势，其中0～12h降低幅度最大，发酵12 h时发酵液pH值即可达到3.6～5.0，继续发酵，发酵液pH值下降减缓。其中菌株L-6、L-7、L-8发酵液pH值在12 h后均下降至4.0以下，15 h后，菌株L-7、L-8pH值分别达到3.5、3.7，其中菌株L-7产酸能力最强。因此，选择对菌株L-6、L-7和L-8进行后续研究。

2.2 形态学鉴定结果

将菌株L-6、L-7和L-8接种于MRS培养基，37℃培养48 h，进行菌株的形态学鉴定，结果见图2。

由图2可知，菌株L-6菌落呈白色、圆形、表面光滑、不透明、边缘整齐，菌体成球形或椭球型，呈短链或长链排列。菌株L-7菌落呈白色、近圆形、表面光滑、不透明、边缘整齐，菌体成杆状，成对或成链排列。菌株L-8菌落呈白色、近圆形、表面光滑、不透明、边缘整齐，菌体成短杆状，成对或成堆排列。

图2 菌株L-6、L-7和L-8的菌落特征（A）和菌株形态（B）Fig.2 Colony characteristics(A)and strain morphology(B)of strains L-6,L-7 and L-8

2.3 生理生化特性鉴定结果

菌株L-6、L-7和L-8生理生化鉴定结果见表1。

表1 菌株L-6、L-7、L-8生理生化试验鉴定结果Table 1 Identification results of physiological and biochemical experiments of strains L-6,L-7 and L-8

由表1可知，菌株L-7可以利用葡萄糖发酵产酸不产生气体、不产生吲哚、不液化明胶、不还原硝酸盐、分解精氨酸不产生氨气。菌株L-6、L-8同样可以利用葡萄糖发酵产酸同时产生气体、不产生吲哚、不液化明胶、不还原硝酸盐、分解精氨酸不产生氨气。通过与标准菌株的生化特性对比发现[15]，菌株L-7属于同型发酵乳酸杆菌，其特性与植物乳酸杆菌标准菌株试验结果一致。菌株L-6、L-8属于异型发酵乳酸杆菌，其特性与肠膜明串珠菌、短乳杆菌标准菌株试验结果一致。

2.4 菌株16SrDNA基因序列测定结果及系统发育树的构建

将筛选的3株菌L-6、L-7和L-8的基因组DNA提取后进行目的片段扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3。

图3 分离菌株16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification products of isolated strains

由图3可知，3株菌经PCR扩增后，在1 500 bp处均出现特异性条带，与预期片段大小一致，说明扩增成功，而且条带比较纯，不用再纯化。利用Blast程序与GenBank中已登录的基因序列进行对比，获得已定名的与之相似的属、种的相关信息。采用MEGA 5.0软件中的邻接法构建发育树和同源性分析结果见图4。

图4 分离菌株16S rDNA基因序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences of isolated strains

由图4可知，3株菌株的16S rDNA序列扩增产物的核苷酸序列与Genebank中序列比对，同源性均＞99%。因此L-8与短乳杆菌（Lactobacillus brevis）AB548884.1的相似度为99%；菌株L-7与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的亲缘关系比其他菌株近，菌株L-6与肠膜明串珠菌（Lactobacillus mesenteroides）M23035具有较高的同源性。结合菌株的菌落形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析，确定菌株L-6、L-7和L-8分别被鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。

3 结论

本研究从自然发酵骆驼酸乳、马奶、自然发酵辣椒酱中分离得到了3株高产酸菌株，并采用形态学、生理生化特性和16S rDNA序列分析对其进行鉴定。菌株L-6、L-7和L-8分别被鉴定为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）、短乳杆菌（Lactobacil lusbrevis）。产酸试验结果表明，这3株菌均具有较强的产酸能力，发酵12 h后发酵液pH值可达4.0以下，其中菌株L-7产酸能力最强，在15 h后其发酵液pH值在3.5以下，符合乳酸菌剂的筛选标准，为乳酸菌在果蔬发酵中的应用奠定了菌种基础，对新疆乳酸菌资源的收集和积累具有重要意义。参考文献：

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Selection,isolation and identification of lactic acid bacteria from Xinjiang speciality foods

YANG Yuxin,WEI Peng,LI Dan,YANG Jie,SONG Zhen*
(Xinjiang Central Asia Food Research and Development Centre,Urumqi 830000,China)

Three strains were isolated and screened from naturally fermented foods in Xinjiang foods by traditional culture method,and were identified by strain morphological,physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis.The results showed that strains L-6,L-7 and L-8 were identified asLeuconostoc mesenteroides,Lactobacillus plantarumandLactobacillus brevis.The results of acid-producing experiments showed that three strains all had stronger acid-producing ability.After fermentation of 12 h,the pH value of fermentation liquid was less than 4.0. The acid-producing ability of strain L-7 was the strongest and the pH value of its fermentation liquid was less than 3.5 after fermentation for 15 h. Strain L-7 could be used for development and preparation of leavening agents of chilli sauce or other fermented foods.

Xinjiang speciality foods;lactic acid bacteria;selection;identification

TS201.3

0254-5071（2017）04-0050-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.011

2016-12-27

新疆维吾尔自治区科技支疆项目（NO.2016E02021）

杨玉新（1968-），男，高级工程师，硕士，研究方向为食品加工。

*通讯作者：宋振（1990-），女，工程师，硕士，研究方向为食品工程。