一株产海藻糖合酶假单胞菌菌株的分离及鉴定

王一雯，权淑静，马焕，陈国参，刘德海*

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

一株产海藻糖合酶假单胞菌菌株的分离及鉴定

王一雯1，2，权淑静2，马焕2，陈国参1，刘德海1*

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

由薄层层析法检测试验发现，从昆明磷矿粉中分离出的一株真细菌，其粗酶液能将麦芽糖异构化为海藻糖。通过显微观察发现，该菌株为革兰氏阴性菌，无色、杆状、具有鞭毛；菌体直径大小0.6～0.8 μm，长度约1.4～2.0 μm；胞内没有聚-β-羟丁酸（PHB）包含体；最佳生长温度为30℃，最适生长pH为7.0。经16S rRNA序列比对、DNA（G+C）mol%和DNA-DNA杂交等分子生物学技术以及生理生化特性检测后，认定该菌株为假单胞菌属（Pseudomonassp.）一种，将其命名为BIE-1。该菌株增加了假单胞菌属菌种多样性，为海藻糖生物合成真细菌菌株提供了新的选择。

假单胞菌属；16S rRNA；DNA-DNA杂交；薄层层析法；海藻糖

海藻糖对称的双分子结构使其具有极强的稳定性，因而被广泛用于新型食品加工、医疗以及生物技术领域[1]。在一些真细菌中，麦芽糖可借助海藻糖合酶（trehalose synthase，TreS）发生分子内结构重排，将麦芽糖还原端的α-1,4糖苷键转为α-1,1糖苷键生成海藻糖，这是完全不同于其他途径的低能耗海藻糖合成方式[2-3]。分子内的葡糖基转移酶不仅利用低成本的麦芽糖为作用底物生成高产值海藻糖，且转化步骤简洁、操纵简单易行，具有极强的工业利用价值[4-5]。因此，寻找更多可利用海藻糖合酶（TreS）的真细菌成为拓展该生产途径的方向之一。

假单胞菌种类多、分布广，一部分假单胞菌是人类、动物和植物的病原体，另一些则具有生物技术应用潜在价值[6]。为发掘高产海藻糖新菌株，从云南昆明市郊磷矿区的磷矿岩粉样品中分离出二十余株真细菌菌株，利用薄层层析法筛选出一株通过TreS途径将麦芽糖转变为海藻糖的真细菌。通过形态学、理化特性和分子生物学对该菌株分类鉴定，不仅增加假单胞菌属菌种多样性，也为海藻糖生产菌提供更多选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

从云南省昆明市郊磷矿厂采集磷矿石样品，通过筛选分离得到若干菌株。参照菌株黄色海假单胞菌KMM1447T：俄罗斯海洋微生物保藏中心；施氏假单胞菌ATCC17588T：美国ATCC菌种保藏中心。

1.1.2 主要试剂

革兰氏染色试剂盒：美国Thermo Fisher科技公司；API 20 NE细菌鉴定试剂条：法国生物梅里埃公司；基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒：美国Axygen公司；GNS-16革兰氏阴性杆菌药敏试剂检测盒：康泰生物制品股份有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.1.3 培养基

菌种保藏培养基（LB培养基）：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，水1 L，pH7.2。

产酶培养基：麦芽糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，牛肉膏2.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，水1 L，pH7.2。

1.2 仪器与设备

Phenom G2 Pure飞纳台式扫面电镜：美国FEI公司；BH-2荧光相差显微镜：日本Olympus公司；6850 N型气相色谱系统：美国Agilent科技公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GF254硅胶板、薄层层析缸（10 cm×10 cm）：青岛海洋化工有限公司；T-GradientThermoblock型聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪：德国Biometra公司；DYY-6C核酸电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株的筛选分离方法

将从昆明磷矿厂采集的样品研磨过筛后，称取1 g样品稀释10-3、10-4、10-5倍后涂布于LB培养基平板，30℃恒温培养观察菌落生长情况。待生长稳定后，分别挑取平板内可见菌落并对其编号。采用平板划线法纯化菌落至获得形态一致的纯菌株若干种。

纯菌株分别转接入发酵培养基，30℃、160 r/min培养48 h，发酵结束后6 000 r/min离心收集菌体，菌体加入适量溶菌酶破壁振荡收集粗酶液，并向其中加同体积10%麦芽糖溶液混合，160 r/min、15 h酶解，10 000 r/min离心收集上清，薄层层析定性分析上清液中的糖成分，挑选并标记上清液中含有海藻糖的菌株。

1.3.2 菌株的海藻糖合酶TreS途径验证

含有海藻糖的菌株发酵粗酶液中分别加同体积5%麦芽糖溶液、5%葡萄糖溶液及ddH2O三种溶液进行酶解试验，薄层层析定性检验海藻糖合成途径[7]。

1.3.3 菌株分类鉴定

（1）菌株形态学及生理生化特性

菌株形态学及生理生化特性：采用革兰氏染色法对菌体细胞染色并借助差相显微镜观察菌体形态。参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]对菌株展开甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验（V-P试验）、硫化氢产生试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、碳源利用试验和药敏测试等各种生理生化特性检测。

（2）菌株胞内脂肪酸和醌类组分检测

以氯仿∶甲醇∶盐酸=1∶10∶1（V/V）作为提取液与菌体混合反应1 h，用正己烷萃取脂肪酸甲酯，将萃取液进行气相色谱分析，检测菌株胞内脂肪酸组成[9]；通过液相色谱检测菌株细胞中的醌类成分[10]。

16S rRNA序列扩增及测序：提取待测菌株全基因组DNA并以其为模板，以细菌通用引物F27/R1492进行聚合酶链式反应扩增16S rRNA基因片段。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析无误后交至上海生工生物进行序列检测。测序结果与GenBank数据库和EzTaxon-e数据库中的16S rRNA基因序列比对，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属。

（3）DNA（G+C）mol%含量检测

采用热变性温度测定法检测待测菌株基因组DNA的（G+C）mol%，以大肠杆菌K12的Tm测定值为参照。根据变性过程中各温度和对应的相对吸光度值绘制成DNA热变性曲线，DNA相对吸光度的中点值所对应的温度即为Tm值；所测Tm值带入特定公式计算细胞染色体DNA的（G+C）mol%含量[11]。

（4）DNA-DNA杂交试验

采用十六烷基三甲基溴化铵法（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）混合抽提菌体DNA，制样。参照公式（Tor=47.0+0.51×（G+C）%）测定DNA最适复变温度（Tor），按公式计算待测菌株与模式菌株KMM1447T、ATCC17588T间的同源性，公式如下：

式中：Va、Vb为不同的DNA样品每分钟吸光值的减少值，△A/min；Vm为混合样品每分钟吸光值的减少值，△A/min。

（5）系统发育树构建

采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株序列，与本研究分离菌株所测序列一起输入ClusTalx1.8程序进行DNA同源序列排列[12]，以邻接法构建系统发育树，1 000次重复取样进行稳定性验证。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、筛选及海藻糖生成定性检测

将从昆明磷矿厂采集的样品研磨过筛后，通过稀释平板划线法最终纯化筛选出二十余株纯菌株，纯菌株转接入发酵培养基，溶菌酶破壁提取粗酶液，薄层层析定性分析酶反应上清液中含有海藻糖的菌株，最终筛选出一株菌株，将其命名为BIE-1，其薄层层析结果如图1所示。

图1 菌株BIE-1产海藻糖薄层层析色谱图Fig.1 TLC chromatogram of trehalose produced by strain BIE-1

2.2 菌株BIE-1海藻糖合酶TreS途径验证

将菌株BIE-1粗酶液分别与5%葡萄糖、5%麦芽糖以及ddH2O混合反应，其结果见表1。

表1 菌株BIE-1不同底物反应体系的薄层层析定性分析Table 1 TLC qualitative analysis of strain BIE-1 in different substrates reaction system

由表1可知，该菌株可利用麦芽糖生成海藻糖，是一株通过海藻糖合酶（TreS）途径生产海藻糖的菌种。将该菌株于-80℃冻存并进行物种鉴定。

2.3 菌株BIE-1的分类鉴定

2.3.1 菌株BIE-1形态结构观察

显微观察结果（图2）发现，菌株BIE-1是革兰氏阴性菌、无色、杆状、有一个极性鞭毛。菌落直径大小0.6～0.8μm，长度1.4～2.0 μm；胞内没有聚-β-羟丁酸（poly-β-hydroxybutyrate，PHB）包含体。培养2 d后，菌落呈圆环状，不透明且有淡黄色的放射状褶皱。

图2 菌株BIE-1透射电镜显微图Fig.2 Transmission electron micrographs of strain BIE-1

2.3.2 菌株BIE-1生理生化特性

菌株BIE-1与模式菌株黄色海假单胞菌KMM1447T、施氏假单胞菌ATCC17588T和78-123T[13]3株假单胞菌理化特性比较见表2。

由表2可知，菌株BIE-1好氧，最佳生长温度为30℃，生长温度区间4～42℃；最适pH为7.0，可适应pH区间为5.0～9.0；耐盐浓度范围0～6%。其常规检测结果表明，明胶液化试验、甲基红试验、V-P试验、硫化氢产生试验为阴性反应；淀粉水解试验和硝酸盐还原试验为阳性反应。API-ZYM试剂条及碳源利用试验共同检测菌株BIE-1可利用碳源有D-葡萄糖、甘露糖、甘露醇、D-麦芽糖、丙三醇、乙醇、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺和苹果酸等12种；扩散法检测BIE-1药敏性发现该菌株受到标准浓度下氯霉素、红霉素、青霉素、利福平、万古霉素、新霉素、杆菌肽、新生霉素、诺氟沙星和环丙沙星抗生素等10种抗生素抑制，但会对卡那霉素产生抗性。表2比较结果显示，菌株BIE-1与3株假单胞菌模式菌株理化特性相近。

表2 菌株BIE-1与近缘属假单胞菌的理化特性比较Table 2 Comparison of physicochemical properties of strain BIE-1 and strains closely related speciesPseudomonassp.

2.3.3 菌株BIE-1胞内脂肪酸和醌类成分检测

提取菌株BIE-1胞内脂肪酸，将脂肪酸皂化、甲基化后进行成分鉴定。菌株BIE-1和三株模式菌种胞内脂肪酸不同成分的含量比较见表3，由表3可知，脂肪酸含量在10%以上的有C18：1ω7c（30.5%）、C16：0（23.6%）及C16：1ω7c/C16：1ω6c（20.5%），最主要的羟基脂肪酸是C12：03-OH（3.6%）。黄色海假单胞菌KMM1447T、施氏假单胞菌ATCC17588T和78-123T的这3种脂肪酸含量也均在10%以上。而泛醌类成员辅酶Q-9则为该菌株胞内主要的醌类成分，经检测菌株BIE-1与假单胞菌属三株模式菌种均含有辅酶Q-9，推测菌株BIE-1应为假单胞菌属菌种。

表3 菌株BIE-1与近缘属假单胞菌的胞内脂肪酸成分及含量比较Table 3 Comparison of intra cellular fatty acids compositions and contents of strain BIE-1 and its closely related species Pseudomonassp.%

2.3.4 菌株BIE-1 DNA的（G+C）mol%

以大肠杆菌K-12的（G+C）mol%含量（51.2%）为参照，由公式计算出菌株BIE-1染色体DNA中的（G+C）mol%含量为60.3%。已知的黄色假单胞菌KMM1447T（G+C）mol%含量为59.1%，施氏假单胞菌ATCC17588T（G+C）mol%含量为61%～66%，待测菌株与二者相比，（G+C）mol%含量差别依次为1.2%、0.7%～5.7%，均低于10%，可确定待测菌株为同属假单胞菌。

2.3.5 菌株BIE-1与菌株KMM1447T、菌株ATCC17588T的

DNA-DNA杂交试验

在一个配有温控设备的Beckman DU 800分光光度计中进行DNA-DNA杂交试验。结果显示，菌株BIE-1与黄色假单胞菌KMM1447T进行DNA-DNA杂交后，二者关联度为（34.18±0.82）%；与施氏假单胞菌ATCC17588T的关联度为（38.92±3.44）%。菌株BIE-1与以上两菌株的DNA同源性小于70%，说明待测菌株是与二者不同种的新菌株。

2.3.6 16S rRNA序列分析及系统发育树构建

构建的系统发育树中菌株BIE-1与近缘种间的位置关系，结果见图3。

菌株BIE-1的16S rRNA基因序列全长1 498 bp。将该序列与已公布序列比较，发现该菌株虽然属于假单胞菌属，但与该属其他菌株在16S rRNA基因序列上出现明显差异。其中，待测菌株与黄色假单胞菌KMM1447T的16S rRNA基因序列相似性最高，为98.9%；与施氏假单胞菌ATCC17588T的相似性为98.06%。由16SrRNA基因序列的相似性关系可知该菌株确为假单胞菌属成员。综合多项分类鉴定分析，认定该菌株BIE-1为假单胞菌属（Pseudomonassp.）中的一种。

图3 菌株BIE-1的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain BIE-1

3 结论与展望

对从云南昆明采集磷矿石样品分离出一株产海藻糖合酶的真细菌进行物种鉴定，显微观察发现该菌株为革兰氏阴性菌，无色、杆状，有一个极性鞭毛，直径约0.6～0.8 μm，长度约1.4～2.0 μm；体内没有聚-β-羟丁酸（PHB）包含体，培养两天后，菌落呈圆环状、不透明且有淡黄色的放射状褶皱，该菌株经16S rRNA序列比对、DNA（G+C）mol%和DNA-DNA杂交等分子生物学技术以及生理生化特性检测后，认定该菌株为假单胞菌属（Pseudomonassp.）一种，将其命名为BIE-1。

有关假单胞菌产海藻糖的研究大多见于海洋假单胞菌和恶臭假单胞菌两大菌株[14-18]，稀缺的菌种资源限制了海藻糖的多样高产研发。菌株BIE-1的发现有利于增加产海藻糖假单胞菌的多样性，便于从中比较挑选出高产、高转化率以及转化性能稳定的优良菌株。将麦芽糖通过分子内结构异位转为海藻糖的海藻糖合酶（TreS）途径已使假单胞菌成为众多产海藻糖微生物中的优势菌种，麦芽糖转化率可达80%以上，其潜在的商业价值随着利用真细菌生产海藻糖的大规模生产而日益显现。

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Screening and identification of trehalose synthase-producingPseudomonassp.

WANG Yiwen1,2,QUAN Shujing2,MA Huan2,CHEN Guocan1,LIU Dehai1*
(1.Institute of Biology Co.,Ltd.,Henan Academy of Science,Zhengzhou 450008,China; 2.Henan Engineering Research Center of Industrial Enzymes,Zhengzhou 450008,China)

A eubacterium was isolated from ground phosphate rock in Kunming,the detection results of thin layer chromatography(TLC)showed that the strain crude enzyme liquid could iosmerize maltose heterogeneous into trehalose.Through microscopic observation,the strain was gram-negative bacterium,colourless,rod-shaped,with a flagellum,0.6-0.8 μm in diameter and about 1.4-2.0 μm in length.No accumulation of poly-β-hydroxybutyrate(PHB)granules as inclusion bodies was observed.The optimal growth temperature of the strain was 30℃and the optimal pH was 7.0.The strain was identified asPseudomonassp.and named BIE-1 by biological techniques(including 16S rRNA sequence analysis,DNA(G+C)mol%, DNA-DNA hybridization,etc.)and physiological-biochemical characteristic.It increased the species diversity ofPseudomonassp.,which provided new choice for the trehalose biosynthesis by eubacteria.

Pseudomonassp.;16S rRNA;DNA-DNA hybridization;thin layer chromatography;trehalose

Q785

0254-5071（2017）04-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.013

2017-01-09

2015年河南省科技创新杰出人才项目（154200510025）

王一雯（1989-），女，硕士，研究方向为酶工程。

*通讯作者：刘德海（1970-），男，研究员，本科，研究方向为酶工程。