响应面法优化石花菜酸奶发酵工艺研究

朱丰，刘施琳，李天骄，林圣楠，黄金城，王红丽，赵艺凡，林向阳*

（福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

响应面法优化石花菜酸奶发酵工艺研究

朱丰，刘施琳，李天骄，林圣楠，黄金城，王红丽，赵艺凡，林向阳*

（福州大学生物科学与工程学院，福建福州350108）

采用响应面法优化石花菜酸奶发酵工艺。采用中心组合试验设计，考察不同双歧杆菌接种量、石花菜添加量、蔗糖添加量、发酵时间对感官评价（R1）、活菌数（R2）两个指标的影响。结果表明，石花菜琼胶寡糖能增加酸奶的持水力，改变酸奶的组织状态。石花菜酸奶发酵的最佳工艺条件为蔗糖添加量11%、石花菜添加量20%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间为6 h，感官评分为80分，活菌数为2.65×109CFU/mL。

石花菜（Gelidium amansii）又名洋菜、燕菜精、石生花，是一种重要的海产经济红藻[1]，是具有很高食疗和经济价值的植物胶。在我国黄海、渤海、东海等海域以及朝鲜、日本等地均有分布。石花菜富含褐藻酸盐类物质、淀粉类硫酸酯、矿物质和多种维生素等营养物质，具有降压、降血脂、清肺化痰、滋阴降火、清热燥湿和解暑功效。其营养均衡，含有丰富的膳食纤维，热量低[2]，是一种备受欢迎的减肥保健食品。石花菜琼胶寡糖是一种新型的益生元[3]，能刺激双歧杆菌与乳酸杆菌在肠道中的生长，改善肠道菌群结构[4-5]。目前，我国对石花菜产品的开发利用尚不充分，主要加工成果冻，造成较大资源浪费。酸奶中含有大量活性益生菌，其营养丰富，具有独特风味。将石花菜琼胶和寡糖添加到酸奶中，不仅可以发挥石花菜生理功能，改善酸奶质构，还可以促进益生菌生长[6-7]。本试验将石花菜与全脂奶粉混合发酵，制成集海藻营养与动物营养于一体的保健型酸奶，以活菌数、感官评价为考察指标，对蔗糖添加量、石花菜添加量、双歧杆菌接种量、发酵时间进行优化，为石花菜应用提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

石花菜：青岛海悠悠商贸有限公司；高蛋白脱脂高钙奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；白砂糖（食品级）：厦门古龙食品有限公司；双歧杆菌：杜邦丹尼斯克公司；石花菜琼胶寡糖：实验室前期制备；厌氧产气袋、圆底立式培养袋、氧气指示剂：青岛雅各化学试剂销售有限公司；MRS琼脂培养基：杭州百思生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

CJM-SC-A型高能纳米冲击磨：秦皇岛太极环纳米制品有限公司；MINI MR核磁共振分析仪：上海纽迈电子科技有限公司；FM200实验室高剪切分散乳化机：上海弗鲁克流体机械制造有限公司；KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；BC/BD-217CH冷柜：河南新飞电器有限公司；BS110S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HZP-150型全温振荡培养箱：上海精宏实验设备有限公司；双人超净工作台：东莞市百福盛净化设备科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

石花菜的前处理：将干净的石花菜经高能纳米冲击磨粉碎得到石花菜粉末，然后在石花菜粉中加入蒸馏水，在90℃、80 kHz条件下超声120 min，充分提取石花菜中的营养成分，并趁热抽滤得石花菜提取液。

复原乳制备：脱脂奶粉与水配制成12.5%的复原乳。

石花菜琼胶寡糖前期制备：称取适量石花菜粉末备用，加入一定体积的2%（V/V）食品级磷酸溶液，置于高温灭菌锅中高温高压一段时间，使石花菜琼胶充分降解。取出后过滤，滤液用食品级氢氧化钠调pH值至7，加入3倍体积乙醇溶液4℃下静置过夜。离心（7 000 r/min，20 min）去除沉淀，经减压浓缩得到琼胶降解产物。

混合均质：将复原乳和白砂糖按一定比例加入热的石花菜提取液中，并加入10 g/L石花菜琼胶寡糖，用高剪切分散乳化机13 000 r/min均质2 min。

灭菌冷却：将混合液巴氏灭菌30 min后备用。

接种发酵：将酸奶发酵剂接种于冷却后的混合液中，置于43℃恒温培养箱内发酵4～6h至凝乳，酸度达70～80°T即可停止发酵。

冷藏后熟：将已经凝固的酸奶置于4℃冰箱中冷藏24h，以降低益生菌活力和产酸速度，产生良好的风味[8-11]。

1.3.2 单因素试验设计

（1）蔗糖添加量：石花菜添加量25%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间5.5 h时，考察蔗糖添加量（7%、9%、11%、13%、15%）对酸奶活菌数及感官评价的影响。

（2）石花菜添加量：蔗糖添加量11%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间5.5 h时，考察石花菜添加量（10%、15%、20%、25%、30%）对酸奶活菌数及感官评价的影响。

（3）双歧杆菌接种量：蔗糖添加量11%，石花菜添加量25%，发酵时间5.5h，考察双歧杆菌接种量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）对酸奶活菌数及感官评价的影响。

（4）发酵时间：蔗糖添加量11%，石花菜添加量25%，双歧杆菌接种量1.5%，考察发酵时间（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）对酸奶活菌数及感官评价的影响。

1.3.3 响应面试验

根据单因素试验结果，选择双歧杆菌接种量（A）、石花菜添加量（B）、蔗糖添加量（C）、发酵时间（D）作自变量，以活菌数（R1）、感官评分（R2）为响应值，进行响应面优化试验。3次平行试验，取平均值。响应面试验设计因素与水平见表1[12]。

表1 酸奶发酵条件优化响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for yogurt fermentation conditions optimization

1.3.4 指标测定

活菌数测定：依照GB 19302—2010《发酵乳》对活菌数进行测定，3次平行试验，取平均值[13]。

感官评定：参照GB 19302—2010《发酵乳》中所列的检验项目，本研究采用双盲法邀请15个经过专业感官训练的研究生对石花菜酸奶的色泽、气味、凝乳状态、口感等感官指标进行评定。3次平行试验，取其平均值作为最终评价结果，满分100分，感官评分标准见表2[14]。

表2 石花菜酸奶感官评定标准Table 2 Sensory evaluation standard forGelidium amansiiyogurt

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蔗糖添加量对活菌数及感官评价的影响

由图1可知，随着蔗糖添加量的增加，感官评分先增加后减小，当添加量为11%时感官评分最高。这是因为蔗糖能促进双歧杆菌的生长，产生的风味物质掩盖石花菜的海藻腥味，当蔗糖添加量过多时会造成甜度过高，且发酵过度产酸量增大，导致感官评分下降。随着蔗糖添加量的增加，活菌数也呈先增加后减少趋势，当添加量为11%时活菌数最高。可能是因为蔗糖添加量增加，菌生长可利用的碳源增多，活菌数随之增加。当蔗糖添加量过多时，高渗透压影响了菌的生长，造成菌脱水死亡，活菌数随之减少。因此，蔗糖最适添加量为11%。

图1 蔗糖添加量对石花菜酸奶感官评分及活菌数的影响Fig.1 Effect of sucrose addition on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

2.1.2 石花菜添加量对活菌数及感官评价的影响

图2 石花菜添加量对石花菜酸奶感官评分及活菌数的影响Fig.2 Effect ofG.amansiiaddition on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

由图2可知，随着石花菜添加量的增加，感官评分也先增加后减小，当添加量达20%时，感官评分最高。这是因为石花菜的添加量使得酸奶口感变得细腻润滑，当石花菜添加量过多，海藻风味过重，影响感官。随着石花菜添加量的增加，活菌数也先增加后减小，当添加量达20%时，活菌数最多。这是因为随着石花菜添加量的增大，菌所能利用的能量充足，使得发酵充分，当石花菜添加量过大时，形成高渗透压，不利于双歧杆菌生长，活菌数减少[15-16]。因此，石花菜最适添加量为20%。

2.1.3 双歧杆菌接种量对活菌数及感官评价的影响

由图3可知，随着双歧杆菌接种量的增加，感官评分先增加后减小，当添加量为1.5%时，感官评分最高。这是因为益生菌使乳糖转化成乳酸，乙醛的产量与酸度有关，接种量较少的时候，发酵不完全造成口感酸度不够，接种量过多的时候会造成凝乳中蛋白质脱水，使乳清析出较多，影响感官。活菌数也随双歧杆菌接种量增加先增加后减小，这主要是因为接菌量越多，菌繁殖越快。当接菌量过多时，酸对菌有抑制作用，使活菌数减少。因此，最佳接种量为1.5%。

图3 双歧杆菌接种量对石花菜酸奶感官评分及活菌数的影响Fig.3 Effects ofBifidobacteriuminoculum on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

2.1.4 发酵时间对活菌数及感官评价的影响

图4 发酵时间对石花菜酸奶感官评分及活菌数的影响Fig.4 Effects of fermentation time on sensory score and viable count ofG.amansiiyogurt

由图4可知，随着发酵时间的增加，感官评分先增加后减小，当发酵时间为5 h时，感官评分最高。这是因为液态奶不断发酵，凝乳形成，产生风味物质，当发酵时间过长，产酸增加，酸会破坏原来已形成的胶体结构，使水分游离出来，造成乳清析出，所形成的酸奶质地松散、口感酸涩。活菌数先增加，后趋于平稳略降低，这是因为随着发酵时间延长，双歧杆菌增长时间增加，活菌数增多。当发酵时间过长，代谢产物累积影响菌生长，活菌数减少[17-19]。因此，最佳发酵时间为5 h。

2.2 模型的建立及参数分析结果

石花菜酸奶发酵中心组合试验设计矩阵及试验结果见表3。蔗糖添加量、石花菜添加量、双歧杆菌接种量、发酵时间对感官评价（R1）、活菌数（R2）的二次多元多项回归式模型：

对于上述各回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验（表4）。各模型方差分析结果显示，活菌数、感官评价2个模型P值均＜0.01，因此感官评价和活菌数的模型极显著；各模型失拟项P值分别为0.071 0和0.401 0，均不显著（P＞0.05）；同时各模型的R2均接近1，表明试验数据与回归数学模型拟合性良好，能够用上述模型较好地预测各指标的实际值。

表3 酸奶发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface methodology for yogurt fermentation conditions optimization

表4 响应面试验结果及方差分析Table 4 Variance analysis of response surface methodology results

各模型回归系数显著性检验结果见表4。由表4可知，各试验因素对感官评价和活菌数2个指标的影响为线性关系且极显著（P＜0.01）；石花菜添加量和双歧杆菌接种量的交互作用、蔗糖添加量的二次项、石花菜添加量的二次项、双歧杆菌接种量的二次项对感官评价和活菌数线性效应极显著（P＜0.01）；蔗糖添加量和石花菜添加量、蔗糖添加量和双歧杆菌接种量、发酵时间的二次项的交互作用对活菌数影响均极显著（P＜0.01），对感官评价影响不显著（P＞0.05）；蔗糖添加量和发酵时间的交互作用对感官评价和活菌数影响均不显著（P＞0.05）。

表5 不同试验因素回归系数的检验Table 5 Testing of regression coefficients of different experimental factors

2.3 响应曲面分析与优化

利用Design-Expert 8.0.6软件中的等高线图和响应曲面图对4因素间的交互作用进行分析。

由图5可知，在双歧杆菌接种量、石花菜添加量和发酵时间不变的情况下，随着蔗糖添加量的增加，感官评分先增加后减小。这主要是一定量的蔗糖促进了细菌的生长，使发酵及代谢加快，产生风味物质掩盖石花菜海藻腥味，但蔗糖添加过多会造成过甜，发酵过度产酸，影响感官。在蔗糖添加量、双歧杆菌接种量和发酵温度不变的情况下，随着石花菜添加量的增加，感官评分也先增加后减小，这是因为随着石花菜添加量，酸奶口感变得细腻润滑，当石花菜添加量过多，海藻风味过重，影响感官。在蔗糖添加量、石花菜添加量、发酵时间不变的条件下，感官评分随双歧杆菌接种量增加先增加后减小，益生菌使乳糖转化成乳酸，乙醛的产量与酸度有关，接种量较少的时候，发酵不完全造成口感酸度不够，接种量过多的时候会造成凝乳中蛋白质脱水，使乳清析出较多，同时也会增加生产成本[20-21]。

图5 蔗糖添加量、石花菜添加量、双歧杆菌接种量交互作用对感官评价影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose addition,G.amansiiaddition and Bifidobacteriuminoculum on sensory evaluation

图6 蔗糖添加量、石花菜添加量、双歧杆菌接种量、发酵时间交互作用对活菌数影响的响应面和等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between sucrose addition,G.amansiiaddition and Bifidobacteriuminoculum on viable count

由图6可知，在双歧杆菌接种量、石花菜添加量和发酵时间不变的情况下，随着蔗糖添加量增加，活菌数增加，蔗糖添加量过多时，高渗透压影响了乳酸菌的生长，造成乳酸菌脱水死亡，活菌数减少[14-15]。在蔗糖添加量、双歧杆菌接种量和发酵温度不变的情况下，随着石花菜添加量的增加，活菌数也先增加后减小，这是因为随着石花菜添加量的增加，菌所能利用的能量充足，使得发酵充分，当石花菜添加量达25%后，形成高渗透压，不利于菌生长，活菌数减少[16]。在蔗糖添加量、石花菜添加量、发酵时间不变的情况下，活菌数随双歧杆菌接种量增加先增加后减少，这主要是因为双歧杆菌接种量增多，菌繁殖加快。当双歧杆菌接种量过多时，酸对菌有抑制作用，活菌数减少。在蔗糖添加量、双歧杆菌接种量和石花菜添加量不变的情况下，随着发酵时间的增加，活菌数先增加后减小。这是因为随着发酵时间延长，双歧杆菌增长时间增加，活菌数增多。当发酵时间过长，代谢产物累积影响菌生长，活菌数减少[22-23]。

2.4 工艺优化参数结果

利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析，以感官评价最高，活菌数最高为优化指标，得到石花菜酸奶发酵工艺为蔗糖添加量11.34%，石花菜添加量20%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间5.93 h，在此条件下模拟预测感官评价为80.58分，活菌数2.83×109CFU/mL。根据实际情况进行修正：蔗糖添加量11%，石花菜添加量为20%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间为6 h。

2.5 验证结果

采用上述最佳工艺进行验证试验，3次平行试验，测定其感官评价及活菌数，得到的平均值分别为80分和2.65×109CFU/mL，与预测值感官评分80.58分和活菌数2.83×109CFU/mL基本相符，表明该二次方程模型对优化石花菜酸奶发酵工艺可行。

3 结论

本研究利用前期试验成果即石花菜琼胶降解后的琼胶寡糖与双歧杆菌进行复配成益生元复合菌，添加入石花菜酸奶中进行发酵，研究蔗糖添加量、石花菜添加量、双歧杆菌接种量和发酵时间对石花菜酸奶发酵的影响。在单因素基础上进行响应面试验优化其工艺条件，得出最佳发酵工艺参数为蔗糖添加量11%，石花菜添加量20%，双歧杆菌接种量1.5%，发酵时间为6 h，经试验得到的感官评分为80分，活菌数为2.65×109CFU/mL，与预测值基本相符。石花菜酸奶与市售酸奶相比，其感官评分较低，风味有待提高，持水性良好，总体符合市售要求。因此，石花菜酸奶的研发对野生深海海藻的利用提供理论依据和试验基础。

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Optimization of fermentation process ofGelidium amansiiyogurt by response surface methodology

ZHU Feng,LIU Shilin,LI Tianjiao,LIN Shengnan,HUANG Jincheng,WANG Hongli,ZHAO Yifan,LIN Xiangyang*
(College of Biological Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The fermentation process ofGelidium amansiiyogurt was optimized by response surface methodology.The effects of differentBifidobacteriuminoculum,G.amansiiaddition,sucrose addition and fermentation time on two response variables including sensory evaluation(R1)and viable count(R2)were investigated by central composite design.The results indicated thatG.amansiiagar oligosaccharide could increase the water holding capacity ofG.amansiiyogurt,and change yogurt structure.The optimum fermentation parameters of the yogurt were as follows:sucrose 11%,G.amansii20%,Bifidobacteriuminoculum 1.5%and fermentation time 6 h.The sensory score and the viable count of the yogurt were 80 and 2.65×109CFU/ml,respectively.

Gelidium amansii;agar oligosaccharide;yogurt;response surface analysis

TS252.54

0254-5071（2017）04-0103-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.022

2017-01-22

福建省科技厅重点项目（2009N0036）

朱丰（1991-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

*通讯作者：林向阳（1969-），男，教授，博士，研究方向为生物质资源化。

关键词：石花菜；琼胶寡糖；酸奶；响应面分析