耐受乙醇巴氏醋杆菌ZJ-25培养基的优化

胡宇豪，李戴阳，汪超，高冰，李冬生，徐宁，胡勇*

（湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北武汉430068）

耐受乙醇巴氏醋杆菌ZJ-25培养基的优化

胡宇豪，李戴阳，汪超，高冰，李冬生，徐宁，胡勇*

（湖北工业大学工业发酵湖北省协同创新中心湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北武汉430068）

以中国传统固态发酵醋醅中分离得到的1株耐受12%vol乙醇的巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）ZJ-25为出发菌株，以产酸量为评价指标，采用单因素试验和正交试验设计对培养基配方进行了优化。结果表明，最佳培养基组合为葡萄糖3%、酵母粉3%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在此最佳培养基条件下，菌株ZJ-25的产酸量由常规培养基条件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。

醋酸菌；耐乙醇；培养基；优化

醋酸菌是酿醋工业的核心菌种。在酿醋工业中，最常用于酿醋的醋酸菌是醋杆菌属（Acetobacter），其中菌株的优劣直接影响成醋的产量、质量及风味[1-3]。巴氏醋酸菌能够更为高效转化酒精生成醋酸，同时其含有丰富的氧化酶系，不仅能够将酒精转化为醋酸，还能氧化形成琥珀酸、柠檬酸等有机酸，对醋的风味形成有较大影响[4-5]。醋酸菌在食品、化工、医药等行业有着较为广泛的应用，在葡萄糖酸和二羟基丙酮的微生物合成中有着重要的作用，该类菌株还具有固氮作用，能用于细菌纤维素的生产[6-8]。

醋酸菌是一类好氧的产酸细菌，乙醇是醋酸发酵的底物，并且为醋酸菌生长代谢提供能量，温度和pH是影响醋酸菌生长和代谢的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的重要条件[9-10]。大多数醋酸菌株可用六碳糖作为碳源，并且在发酵过程中产生大量的代谢产物CO2、醋酸、乳酸、丙酸以及丙酮等。关于培养基的相关研究已经表明，醋酸杆菌发酵的最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉[11-13]，此外，外源乙醇和乙酸也是发酵培养基中常添加的成分[14-15]。

本研究以中国传统固态发酵醋醅中分离得到的1株巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25为出发菌株，碳源选用葡萄糖，氮源选用酵母粉，同时添加不同浓度的乙醇和乙酸，对培养基配方进行正交试验优化，这将为菌种的进一步研究提供理论依据，为菌种的工业应用打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

巴氏醋杆菌（Acetobacterpasteurianus）ZJ-25：由本实验室分离自中国传统固态发酵的醋醅，可耐受体积分数12%的乙醇溶液。

1.1.2 试剂

无水乙醇、氯化钠、葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠：上海化学试剂有限公司；碳酸钙：德兴市明缘化工材料有限公司；酚酞：天津市北辰方正试剂厂；酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司；琼脂：华顺生物技术有限公司；盐酸：西陇化工股份有限公司。所用试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AR323C电子天平：奥豪斯仪器公司；DZ-101C磁力加热搅拌器：巩义市予华仪器有限公司；FE20数显式酸度计、DZF-6050电热恒温培养箱、HH4-电热恒温水浴锅、DHG-9070A恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；DXO 7771大龙移液枪：大龙新创实验仪器有限公司；I8双光束紫外可见分光光度计：济南海能仪器有限公司；HNY-2112B柜式全温震荡培养箱：天津欧诺仪器仪表公司；FY50高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；TGL-20台式高速离心机：武汉中科科仪技术发展有限责任公司；SW-CJ净化工作台：苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高耐受性醋酸杆菌培养基单因素试验

（1）葡萄糖添加量对菌株产酸量的影响：取500mL三角瓶，设置5个处理，葡萄糖添加量分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分为酵母粉3%、乙醇6%、乙酸0.1%，用少量水溶解，并加水定容至150 mL，移至三角瓶中，121℃灭菌15 min；在以下条件下进行揺瓶发酵，将4%醋酸菌液体菌种接种已灭菌的三角瓶发酵培养基中，在温度38℃、pH 5.0、摇床转速160 r/min，发酵时间6 d[16]的条件下每个处理组重复3次，发酵结束后测定发酵液中的产酸量。

（2）酵母粉添加量对菌株产酸量的影响：取500 mL三角瓶，设置5个处理，酵母粉添加量分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，其他成分为葡萄糖3.0%、乙醇6.0%、乙酸0.1%，加水配制成150 mL的培养基，灭菌后接种，按照1.3.1（1）的条件进行揺瓶发酵。

（3）乙醇添加量对产酸量的影响：取500 mL三角瓶，设置5个处理，乙醇添加量分别为4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%，其他成分为葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙酸0.1%，配制成150 mL的培养基，灭菌后接种，按照1.3.1（1）的条件进行揺瓶发酵。

（4）乙酸添加量对产酸量的影响：取500 mL三角瓶，设置5个处理，乙酸添加量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，其他成分为葡萄糖添加量3.0%、酵母粉添加量3.0%、乙酸添加量0.1%，配制成150 mL的培养基，灭菌后接种，按照1.3.1（1）的条件进行揺瓶发酵。

1.3.2 高耐乙醇醋酸杆菌培养基配方正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取葡萄糖、酵母粉、乙醇和乙酸的添加量等4个因素，采用4因素3水平的正交试验对巴氏醋杆菌ZJ-25的发酵培养基配方进行优化，正交试验因素与水平见表1。以发酵结束后的产酸量为评价指标，确定最优培养基配方。

表1 培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for medium formula optimization

1.3.3 菌株产酸量的测定

精密量取3.0 mL样品于250 mL锥形瓶中，加50 mL水，滴加1～2滴酚酞试剂，放入磁力搅拌子并置于磁力搅拌器上搅拌，边搅拌边滴入氢氧化钠标准溶液进行滴定。当溶液由无色变为粉色时停止滴加，读取氢氧化钠标准滴定溶液消耗的体积。具体测定方法参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[17]。

2 结果与分析

2.1 高耐受性醋酸杆菌培养基单因素试验

2.1.1 葡萄糖添加量对菌株产酸量的影响

葡萄糖添加量对菌株产酸量的影响见图1。由图1可知，当葡萄糖添加量为2.0%～3.0%时，随着葡萄糖添加量的增加，菌株产酸量逐步升高，其中葡萄糖添加量为3.0%时，产酸量最高，为36.9 g/L；葡萄糖添加量＞3.0%时，随着葡萄糖添加量的增加，菌株产酸量呈明显下降趋势；当葡萄糖添加量过少时，碳源不足，醋酸菌的数量少，产酸量偏低，当葡萄糖的添加量过多时，消耗了大量的营养物质，导致产酸量过低。因此，葡萄糖的最宜添加量为3.0%。

图1 葡萄糖添加量对菌株产酸量的影响Fig.1 Effect of glucose addition on acid yield of strains

2.1.2 酵母粉添加量对菌株产酸量的影响

图2 酵母粉添加量对菌株产酸量的影响Fig.2 Effect of yeast powder addition on acid yield of strains

酵母粉添加量对菌株产酸量的影响见图2。由图2可知，当酵母粉添加量为2.0%～3.0%时，随着酵母粉添加量的增加，菌株产酸量逐步升高，其中酵母粉添加量为3.0%时，产酸量最高，为37.3 g/L；酵母粉添加量＞3.0%时，随着酵母粉添加量的增加，菌株产酸量呈明显下降趋势。当酵母粉添加量过少时，氮源不足，醋酸菌的数量少，产酸量偏低，当酵母粉的添加量过多时，消耗了大量的营养物质，导致产酸量过低。因此，酵母粉的最宜添加量为3.0%。

2.1.3 乙醇添加量对菌株产酸量的影响

乙醇添加量对菌株产酸量的影响见图3。由图3可知，当乙醇添加量为4.5%～5.5%时，随着乙醇添加量的增加，菌株产酸量逐步升高，其中乙醇添加量为5.5%时，产酸量最高，为42.5 g/L；乙醇添加量＞5.5%时，随着乙醇添加量的增加，菌株产酸量呈明显下降趋势。乙醇会氧化为乙酸，当乙醇添加量过少时，乙酸产量偏低；乙醇添加量过大时，会抑制醋酸菌产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，导致乙酸产量的减少。因此，乙醇的最宜添加量为5.5%。

图3 乙醇添加量对菌株产酸量的影响Fig.3 Effect of ethanol addition on acid yield of strain

2.1.4 乙酸添加量对菌株产酸量的影响

图4 乙酸添加量对菌株产酸量的影响Fig.4 Effect of acetic acid addition on acid yield of strain

乙酸添加量对菌株产酸量的影响见图4。由图4可知，当乙酸添加量为0.05%～0.10%时，随着乙酸添加量的增加，菌株产酸量逐步升高，其中乙酸添加量为0.10%时，产酸量最高，为42.9 g/L；乙酸添加量＞0.10%时，随着乙酸添加量的增加，菌株产酸量呈明显下降趋势。乙酸会刺激醋酸菌产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，添加适宜量的乙酸会增加菌株的产酸量。因此，乙酸的最宜添加量为0.10%。

2.2 高耐受性醋酸杆菌培养基正交试验结果

醋酸菌培养基配方优化正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for medium formula optimization

由表2可知，从正交试验各项因素的极差和离差平方和可以看出各因素对醋酸积累的影响强度依次为葡萄糖＞酵母粉＞乙醇＞乙酸。根据直观分析可得到的优化的菌发酵培养基组合为A2B2C3D1，此时产酸量为43.8g/L。通过极差分析得到最佳的试验组合为A2B2C2D3，将得到培养基优化结果进行验证试验，产酸量为44.5 g/L，通过产酸量的比较，得到最佳的试验组合是A2B2C2D3，即培养基组分为葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%，将得到的培养基优化结果进行3次验证试验，平均产酸量为44.3g/L。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

表3的方差分析表明，葡萄糖和酵母粉添加量对菌株产酸量的影响极显著（P＜0.01），乙醇添加量对产酸量影响显著（P＜0.05），添加乙酸添加量对产酸量的影响不显著。

3 结论

本研究对中国传统固态发酵醋醅中分离得到的1株高耐受性巴氏醋杆菌ZJ-25的培养基进行了优化。通过对培养基中的葡萄糖、酵母粉、乙醇、乙酸的添加量采取正交试验优化，得出该菌的最优培养基成分为葡萄糖3.0%、酵母粉3.0%、乙醇5.5%、乙酸0.12%。在发酵温度32℃、转速180r/min、发酵天数6d、初始pH6.0的发酵条件下，巴氏醋杆菌ZJ-25的产酸量由常规条件下的32.5 g/L提高至44.3 g/L。为巴氏醋杆菌ZJ-25的进一步研究及工业应用提供理论依据。参考文献：

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Optimization of culture medium for ethanol-tolerantAcetobacter pasteurianusZJ-25

HU Yuhao,LI Daiyang,WANG Chao,GAO Bing,LI Dongsheng,XU Ning,HU Yong*
(Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

UsingAcetobacter pasteurianusisolated from vinegar grains of traditional Chinese solid-state fermentation with 12%vol ethanol tolerance as original strain,using acid yield as evaluation index,the medium formula forA.pasteurianusZJ-25 culture for acid production was optimized by single factor and orthogonal experiments.Results showed that the optimal medium formula was as follows:glucose 3%,yeast powder 3%,ethanol 5.5%,acetic acid 0.12%.Under these conditions,the acid yield of strain ZJ-25 increased from 32.5 g/L to 44.3 g/L.

acetic acid bacteria;ethanol tolerant;culture medium;optimization

TS264.2

0254-5071（2017）04-0118-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.025

2016-11-10

湖北省自然科学基金（2015CFB678）；湖北省级教育部门青年人才项目（Q20151412）

胡宇豪（1993-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物和发酵工程。

*通讯作者：胡勇（1980-），男，讲师，博士，研究方向为细胞工程。