黑曲霉利用红薯粉生产柠檬酸的发酵条件研究

徐艳

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

黑曲霉利用红薯粉生产柠檬酸的发酵条件研究

徐艳

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

对黑曲霉利用红薯粉生产柠檬酸的发酵条件进行优化。采用单因素试验考察发酵时间、培养基红薯粉含量、摇床转速、初始pH对柠檬酸产量的影响。在单因素试验的基础上，利用正交试验确定黑曲霉利用红薯粉生产柠檬酸的发酵条件为：发酵时间60 h、培养基红薯粉含量40 g/L，摇床转速200 r/min，初始pH值6.0。在此条件下，柠檬酸产量达4.81 g/L。

黑曲霉；柠檬酸；发酵条件

柠檬酸被称为第一食用酸味剂，在食品工业上极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂、螯合剂等[1]。柠檬酸的生产方法主要有三大类，一是用萃取、吸附、膜分离、工业色谱等分离纯化的方法从柠檬、橙等水果中提取；二是以草酰乙酸与乙烯酮为原料的合成；三是发酵法。提取法单元操作繁琐、提取效率普遍偏低，且需要大量的辅料，还存在废水排放等问题[2-3]。化学合成方法工艺流程复杂，设备和成本要求高，且安全性又很低，因而并不是主流的生产柠檬酸方法。发酵法工艺简单，生产效率高，成本低，无污染，是目前国内外工业生产采用的方法[4-6]。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一类在自然界广泛存在的腐生真菌，多见于土壤、粮食、药材、虫体、枯枝落叶、动物粪便、霉腐物等中。黑曲霉是重要的工业微生物，可以发酵生产有机酸、淀粉酶、纤维素酶等[7]。黑曲霉对发酵条件要求较低，生长迅速，对培养基原料适应性强，并且产量稳定，当前99%的柠檬酸产出于黑曲霉发酵[8]。红薯大约含有20%的淀粉，制成干粉的红薯可直接进行深层发酵产柠檬酸[9-11]。李忠英[12]对产柠檬酸黑曲霉初始含糖量、发酵温度、发酵时间、起始pH、转速等发酵条件进行了优化试验。

目前，我国是世界上最大的柠檬酸生产国和出口国，柠檬酸的发酵技术也处在世界先进水平，用于食品加工的柠檬酸接近70%，在国内，由于不含酒精饮料对柠檬酸的需求较大，市场需求每年以3%～5%的速度增长。我国种植红薯面积广泛，薯类资源丰富，加之黑曲霉菌种适应性很好，对原料的要求低，生产产量相对比较稳定，薯类发酵的条件要求比较低，不需额外添加含氮化合物、无机盐以及其他促进产酸的试剂即可进行。将红薯制成干粉后发酵产生柠檬酸，一方面可以减少固体物料的处理量，使之易于操作，另一方面还可以综合利用这些作物的其他组分。红薯相较于其他薯类，在产酸率和转化率方面有一定的优势。

本研究在分析单因素对红薯粉发酵产生柠檬酸影响的基础上，进行正交试验，研究各因素综合对产生柠檬酸的影响，以期为柠檬酸的生产提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003：中国食品药品检定研究院。

红薯粉：兴化市绿咖园食品有限公司。

1.1.2 试剂

α-高温淀粉酶（5万U/mL）：湖南省新鸿鹰生物工程有限公司；葡萄糖（纯度99.5%）：国药集团化学试剂有限公司；琼脂：北京奥博星生物技术责任有限公司；氢氧化钠（NaOH）、亚硝酸钠（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；磷酸二氢钾（分析纯）：河南焦作市化工三厂；硫酸镁（分析纯）：天津化学试剂一厂；氯化铵（分析纯）：天津市泰兴试剂厂。

1.1.3 培养基

斜面活化培养基：葡糖糖30.0 g，NH4Cl 3.0 g，KH2PO41.0 g，琼脂15.0 g，加入1 L超纯水中煮至微沸，待完全溶解后冷却至50℃左右分装，备用。

液体种子培养基：葡萄糖30.0 g，NaNO33.0 g，KH2PO41.0 g，加入1 L超纯水中煮至微沸，待完全溶解后冷却至室温，调节pH值至6.0分装，冷藏备用。

红薯粉发酵培养基：红薯粉50 g（过20目筛），葡萄糖50 g，NH4Cl 5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加超纯水至1 000 mL，调节pH值为6.0，按10 U/g原料加入α-高温淀粉酶，搅拌至均匀，加热至微沸，保持15 min，待冷却后用0.1%碘液检测不显蓝色即为糖化完全。四层纱布过滤后于立式灭菌锅彻底灭菌，冷藏备用。

1.2 仪器与设备

AB145-S电子天平：上海上天精密仪器有限公司；DH-600恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司；YXQ-LS-50SII立式灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；RH-QW恒温摇床：金坛市天竟实验仪器厂；SW-CJ-JF单人双面净化工作台：苏州金净科技有限公司；SHZ-DIII真空抽滤泵：上海予华仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化与扩大培养

将黑曲霉在无菌条件下用接种环挑取少许，均匀接种在斜面培养基上，于恒温培养箱中35℃培养3 d，至斜面长满黑色孢子从而制得斜面菌种，4℃冷藏备用。

无菌条件下挑取少许活化的黑曲霉菌种于液体种子培养基，35℃恒温摇床培养，直至长出分布均匀的球状菌落（不宜过大，否则后期发酵菌种分布不均），4℃冷藏备用[12]。

1.3.2 红薯粉糖化

配制1 L培养基：称取红薯粉50 g过20目筛，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH值为6.0，按10 U/g原料加入α-高温淀粉酶，搅拌均匀后加热至微沸，保持15 min，冷却后用0.1%碘液检测，不显蓝色即为糖化完全。过滤后彻底灭菌，4℃冷藏备用[13]。

1.3.3 柠檬酸产量测定

将发酵后的发酵液过滤，弃去滤渣，取5 mL发酵液于50mL锥形瓶中，加入2滴酚酞指示剂后摇匀，用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定，至溶液刚好变色，且半分钟红色不褪去。记下消耗的NaOH溶液的体积，重复进行3次试验，取平均值[12-13]。柠檬酸产量计算公式如下：

式中：n为柠檬酸产量，g/L；c为NaOH溶液的浓度，mol/L；M为柠檬酸的分子质量，g/mol；V为消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；1 000为体积换算倍数；3为滴定时一分子柠檬酸消耗3分子NaOH。

1.3.4 单因素试验

选取黑曲霉发酵条件过程中4个关键因素，即发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h和84 h）、培养基红薯粉含量（35g/L、40g/L，45g/L、50g/L、55g/L和60g/L）、初始pH（5.2、5.6、6.0、6.4、6.8和7.2）和摇床转速（100 r/min、200 r/min、300 r/min、400 r/min和500 r/min）进行单因素试验，考察这4个因素对柠檬酸产量的影响。

1.3.5 正交试验[14-15]

根据单因素试验结果，以柠檬酸产量为评价指标，进行L9（34）正交试验设计，从而优化黑曲霉利用红薯粉生产柠檬酸的发酵条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 黑曲霉产柠檬酸发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

2 结果与分析

2.1 发酵时间对黑曲霉利用红薯粉产柠檬酸的影响

图1 发酵时间对柠檬素产量的影响Fig.1 Effects of fermentation time on citric acid yield

由图1可知，随着发酵时间的延长，柠檬酸产量呈先增加后趋于平稳的趋势，在48 h之前，黑曲霉处于调整期与对数生长期主要表现为适应环境，大量繁殖，柠檬酸产量较少；当黑曲霉发酵48 h后，柠檬酸产量上升的趋势明显减缓，说明黑曲霉在48 h左右达到平稳期。而48 h左右黑曲霉达到平稳期，开始大量积累柠檬酸。在48 h之后，柠檬酸的产量虽然一直维持稳定，但是由于菌种的大量繁殖，消耗的营养物质也会迅速增加，发酵周期也过长，因此，选择48 h为最佳的发酵时间。

2.2 培养基红薯粉含量对黑曲霉产柠檬酸的影响

图2 培养基红薯粉含量对柠檬酸产量的影响Fig.2 Effects of medium sweet potato powder contents on citric acid yield

由图2可知，随着培养基红薯粉含量的增加，柠檬酸的产量先上升后稍有下降，再逐渐趋于平稳。当红薯粉含量＜40 g/L时，黑曲霉生长受到抑制，不能繁殖足够多的菌体，菌体浓度偏低，导致产酸量偏低；当红薯粉含量＞40 g/L，黑曲霉菌体浓度过大，产物合成受到抑制，生产速率反而下降。因此，选择培养基红薯粉含量40 g/L为宜。

2.3 初始pH对黑曲霉利用红薯粉产柠檬酸的影响

图3 初始pH对柠檬酸产量的影响Fig.3 Effects of initial pH on citric acid yield

由图3可知，随着培养基中初始pH增大，柠檬酸产量先上升后下降。当初始pH值为5.2～6.4时，柠檬酸产量逐渐增加；当初始pH值为6.4时，黑曲霉利用红薯粉产柠檬酸量达到最大，为4.02 g/L；当初始pH值＞6.4时，柠檬酸产量开始下降。培养基中初始pH值过高或过低时，菌体内的酶活性普遍受到抑制，酶活力活力下降导致其催化的反应速率下降；高的H+或OH-浓度还会改变基质或中间产物的解离度，改变膜的通透性，使代谢的速率减缓。因此选择初始pH6.4为宜。

2.4 摇床转速对黑曲霉产利用红薯粉柠檬酸的影响

图4 摇床转速对柠檬酸产量的影响Fig.4 Effects of shaking rotate speed on citric acid yield

由图4可知，柠檬酸的产量随着摇床转速的增加而迅速变大，当摇床转速＞200 r/min时；黑曲霉的产柠檬酸量趋于稳定，无明显增加。说明培养基达到一定转速后，满足了黑曲霉生长所需的氧气量。因此选择摇床转速200 r/min为宜。

2.5 正交试验

根据单因素试验结果，进行黑曲霉利用红薯粉产柠檬酸发酵条件优化正交试验，结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 黑曲霉产柠檬酸发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of citric acid produced byAspergillus niger

由表2可知，RA＞RC＞RB＞RD，4种因素对柠檬酸产量影响大小依次为发酵时间（A）＞初始pH（C）＞培养基红薯粉含量（B）＞摇床转速（D）。

根据K值可知，最佳因素组合为A2B1C2D1，即发酵时间60 h，发酵培养基红薯粉含量为40 g/L，发酵培养基初始pH值为6.0，摇床转速为200 r/min，在此发酵条件下进行3次验证试验，柠檬酸的产量平均值为4.81 g/L，高于正交试验各组的产量。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，4个因素都对黑曲霉利用红薯粉发酵产柠檬酸有极显著的影响（P＜0.01），4个因素影响的主次顺序为发酵时间（A）＞初始pH（C）＞培养基红薯粉含量（B）＞摇床转速（D），与极差分析结果一致。

3 结论

本试验以红薯粉为原料，采取黑曲霉发酵法制取柠檬酸。对红薯粉利用红薯粉产柠檬酸的发酵条件进行了研究。通过单因素试验和正交设计试验，得出黑曲霉利用红薯粉发酵产柠檬酸的最佳条件为发酵时间60 h、发酵培养基红薯粉含量40 g/L，摇床转速200 r/min，发酵培养基初始pH 6.0。在此条件下，柠檬酸产酸量可达4.81 g/L。

目前国内市场对柠檬酸的需求较大，而我国红薯产量高，本研究将红薯制成干粉后发酵产生柠檬酸，能够对农产品利用提供新的途径，为柠檬酸的生产提供一定的依据。

[1]冯志合，卢涛.中国柠檬醇行业概况[J].中国食品添加剂，2011（3）：158-163.

[2]杨淼，刘海涛，吕惠生.柠檬酸提取工艺的研究进展[J].中国食品添加剂，2013（2）：190-194.

[3]沈爱芳.柠檬酸提取方法的研究进展[J].中国科技博览，2015（20）：63-64.

[4]郑建光，李忠杰，项曙光.柠檬酸生产技术及进展[J].河北化工，2006，29（8）：20-24.

[5]高年发，杨枫.我国柠檬酸发酵工业的创新与发展[J].中国酿造，2010，29（7）：1-6.

[6]王宝石，陈坚，孙福新，等.发酵法生产柠檬酸的研究进展[J].食品与发酵工业，2016，42（9）：251-256.

[7]郭艳梅，郑平，孙际宾.黑曲霉作为细胞工厂：知识准备与技术基础[J].生物工程学报，2010，26（10）：1410-1418.

[8]熊俊君.黑曲霉产柠檬酸效率之研究[J].江西化工，2012，6（2）：97-101.

[9]曾文杰.薯类发酵制取柠檬酸的研究进展[J].农产品加工，2013（9）：59-61.

[10]马旭光，张宗舟，柳芸，等.高产柠檬酸黑曲霉菌株的航天诱变选育及其产酸条件的研究[J].中国酿造，2012，31（5）：40-44.

[11]杜连启.薯渣生产柠檬酸和柠檬酸钙的技术[J].农产品加工，2010（2）：30-31.

[12]李忠英.产柠檬酸黑曲霉菌种诱变选育及发酵条件优化[J].中国酿造，2014，33（11）：94-97.

[13]赵子威，伍时华.木薯粉液化滤液发酵产柠檬酸的条件优化[J].贵州农业科学，2013，41（8）：187-190.

[14]李云雁，胡传荣.试验设计与数据处理[M].北京：化学工业出版社，2008：7.

[15]朱德艳.乙醇回流法提取葛根黄酮的工艺优化研究[J].中国酿造，2015，34（11）：145-148.

Fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder

XU Yan
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

The fermentation conditions of citric acid production byAspergillus nigerusing sweet potato powder were optimized.The effects of fermentation time,sweet potato powder content in medium,shaking rotate speed and initial pH on citric acid yield were investigated by single factor experiments.On the basis of single factor experiments,the fermentation conditions were determined as time 60 h,sweet potato powder content 40 g/L, shaking rotate speed 200 r/min and initial pH 6.0 by orthogonal experiments.Under the conditions,the citric acid yield was up to 4.81 g/L.

Aspergillus niger;critic acid;fermentation conditions

TS261.12

0254-5071（2017）04-0127-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.027

2016-11-25

荆楚理工学院新农村研究项目（2016Z002）

徐艳（1981-）女，讲师，硕士，研究方向为植物资源开发与利用。