呈味肽的制备、纯化与鉴定

邓莉，郝学财，刘娜

（天津春发生物科技集团有限公司研发中心天津市风味食品配料企业重点实验室，天津300300）

呈味肽的制备、纯化与鉴定

邓莉，郝学财，刘娜

（天津春发生物科技集团有限公司研发中心天津市风味食品配料企业重点实验室，天津300300）

采用酶解法以鸡肉为原料进行鸡肉蛋白多肽的制备，通过葡聚糖凝胶柱层析法对混合多肽进行不同分子质量片断的分离，确定最优的分离填料为G25、洗脱液为乙醇-水，在此条件下，分子质量＜1 000 u的组分通过分离富集含量可达100%、分子质量＞5 000 u的组分含量达78%、分子质量1 000～5 000 u的组分含量达70%。通过感官评价、电子舌分析发现，不同分子质量片段多肽提供的风味侧重点不同，分子质量＜1 000 u的多肽热反应产物在醇厚感、嗜好性方面最优。利用高效液相色谱、液质联用仪对该肽段进一步纯化与鉴定，找到其中5条呈味肽，并采用固相合成法制备，经感官评价验证其呈味功能，发现在清水评价中，合成的5条多肽呈味效果以酸、甜、鲜味为主；在鸡粉溶液加香评价中，呈现鲜味最强的多肽为γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈现醇厚感最强的多肽为L-GSH。

呈味肽；酶解；分离；纯化；鉴定

呈味肽是指对食品风味具有一定贡献的寡肽类物质，通常分子质量＜5 000 u。肽由于含有羧基和氨基两性基团而具有缓冲能力，可赋予食品微妙而细腻的风味。肽不仅可以直接呈味，而且可以与其他风味物质相互协同，增强或改变原有的味道，也可以作为挥发性风味物质的前体参与美拉德反应，形成特殊的芳香化合物[1-2]。

研究表明，肽的呈味功能与其含有的氨基酸种类及序列相关，存在于天然食品中的氨基酸大约有20余种，无论是单一还是混合的氨基酸，都可以清楚地评估出其对食品呈味的作用。然而，肽类是由氨基酸排列组合构成，其数量十分庞大，利用现有的分离、分析技术逐一对其进行分离、纯化、鉴定、评估极其困难。目前，呈味肽的研究在国内尚处于起步阶段，国外不同学者的研究结论也存在争议[3-5]。

本实验采用酶解法以鸡肉为原料进行鸡肉蛋白多肽的制备，经柱层析实现不同分子质量多肽的分离，利用感官评价、电子舌技术确定最具呈味功能的多肽片断，再利用高效液相色谱、液质联用仪纯化、鉴定出5条呈味肽，而后，采用固相合成法制备并验证了其呈味功能，以期为新型呈味物质的发现、应用以及高品质香精、调味品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡肉：山东凤翔集团；复合蛋白酶（FH-G-NA-ⅩⅡ）：天津诺奥科技发展有限公司；葡聚糖凝胶柱填料（G10、G15、G25）：北京索莱宝科技有限公司；甘氨酸、亮氨酸、半胱氨酸（纯度均为99%）：日本味之素公司；乙腈、乙醇（纯度均为色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、磷酸二氢钠、苯酚（纯度均为99%）：天津市风帆化学试剂科技有限公司；标准品细胞色素C、抑肽酶（6 500 U/g）、杆菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸（纯度均为99%以上）：美国Sigma公司；H-CTC树脂：天津南开和成公司；N，N'-二异丙基碳二亚胺（N,N-diisopropylcarbodiimide，DIC）、1-羟基苯并三唑（Nhydroxybenzotrizole，HOBt）（纯度均为99%）：成都西亚化工股份有限公司；乙二硫醇（1,2-ethanedithio，EDT）、茚三酮、六氢吡啶（piperidine，PIPE）、N,N′-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）（纯度均为99%）：百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AC1000全自动热反应釜：北京世纪森朗实验仪器有限公司；1200高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）（带馏分收集器）：美国安捷伦科技有限公司；3100 Mass液质联用仪（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）：美国沃特世科技（上海）有限公司；JMS-50胶体磨：顶天轻工机械有限公司；SJM-FHM-05陶瓷膜过滤装置：世杰膜工程有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；BS-100A自动部分收集器：上海青浦沪西仪器厂；Astree电子舌：法国Alpha MOS公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鸡肉多肽的制备

取鸡肉，先后利用破碎机、胶体磨处理成鸡肉泥，肉泥与水等质量充分混合，加入蛋白酶酶解，加酶量为1 000 U/g蛋白质，在自然pH，酶解温度为65℃条件下酶解0.5 h后，于90℃灭酶15 min，降温后过陶瓷膜滤去大分子杂质。

1.3.2 多肽的分离

将1.3.1中得到的酶解液采用葡聚糖凝胶过滤柱法进行不同分子量多肽的分离。首先以葡聚糖凝胶G25为填料填装层析柱，以水、乙醇-水、磷酸盐缓冲液（phosphatebuffer solution，PBS）、NaCl-PBS四种洗脱液分别洗脱，考察得到最优的洗脱液种类；再分别以G25、G15、G10为填料填装层析柱，在其他条件不变的情况下，考察得到最适的填料种类。实验利用自动馏分收集器进行级分收集，间隔时间为5 min，洗脱速度为1 mL/min。

1.3.3 分离效果检测方法

采用凝胶过滤色谱法测定多肽分离效果，实验仪器为HPLC，色谱柱选用TSK-GELG2000SWXL7.8mm×300mm，色谱条件为柱温30℃，流动相乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1，流速为0.5mL/min，检测波长220nm，进样量为10mL。以标准品细胞色素C、抑肽酶、杆菌肽、甘氨酰-甘氨酰-酪氨酰-精氨酸、甘氨酰-甘氨酰-甘氨酸做分子质量分布标准曲线。

1.3.4 不同分子质量多肽的风味评价

（1）美拉德反应

按照表1基本配方，分别称取1.3.2中得到的不同分子质量肽段多肽、未分离多肽、空白对比样，与其他美拉德反应原料一同投入反应釜中，温度升至99℃时，开始计时，保持（100±1）℃，反应90 min，冷却降温，取样品进行感官评价及电子舌分析。

表1 反应物配方Table1 Formula of reaction substrate

（2）感官评价

取上述美拉德反应后的样品，用55℃纯净水稀释100倍后，进行感官评价。感官评价小组由8名训练有素的感官评价员组成，每评价一个样品后需用清水漱口。

感官评价指标包括鸡肉特征、鲜味、醇厚感、持续性、嗜好性，每个指标按照强度的由弱到强，在0～9分范围内评分。

（3）电子舌分析

本实验所用电子舌设备的传感器系统包括酸味（sourness，SRS），甜味（sweetness，SWS），苦味（bitterness，BRS），咸味（saltiness，STS），鲜味（umami，UMS），综合1（GPS）综合2（SPS）共7根传感器，选择Ag/AgCl作为参比电极。传感器经活化、校正后测样。

样品处理方法为取上述美拉德反应后的样品1 g，加入100 mL蒸馏水溶解、过滤后，添加于专用的25 mL烧杯中检测。

1.3.5 呈味肽的纯化

利用反相高效液相色谱对1.3.4中风味评价效果最优的肽段中的混合多肽进一步纯化。高效液相色谱法的分离纯化条件为色谱柱XDB C18；流动相采用A：0.05%TFA-水、B：0.05%TFA-乙腈洗脱；流速1.0mL/min；检测波长220nm；柱温30℃。

1.3.6 呈味肽的鉴定

利用液质联用仪对1.3.5中纯化后的多肽进行进一步分离、鉴定其氨基酸序列。质谱检测条件为模式ESI+/ESI-，电离电压3.2 kV，离子源温度120℃，雾化温度350℃，雾化气流速600 L/h，锥孔气流速50 L/h，锥孔电压30 V。

1.3.7 呈味肽的合成[6-27]

根据1.3.6中鉴定出的多肽序列，结合文献报道的氨基酸、多肽呈味效果，选择其中5条最有可能具有呈味贡献的多肽进行固相合成。合成、纯化方法如下：

采用手动固相Fmoc法，以H-CTC树脂（取代值为1.0 mmol/g）为起始原料，从C端向N端方向合成。用2倍当量Fmoc-AA-OH/DIPEA与树脂进行接枝引入C端第一个氨基酸残基，反应时间2 h。而后，用25%六氢吡啶/DMF（体积比）去除N端Fmoc保护基使N端成为自由氨基。用3倍当量Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt与树脂反应以接枝第二个氨基酸残基。如此反复依次连接各个氨基酸残基以完成整条多肽的合成。以上每步反应后都需用DMF洗涤树脂6次以上，并且都通过Kaiser Test检测来对反应进行控制，若某个氨基酸缩合反应不完全，重复缩合一次，直至得到所需的目标肽段。切割及去侧链保护，使用切割试剂（三氟乙酸∶1,2-乙二硫醇∶苯甲硫醚∶苯酚∶H2O∶三异丙基硅烷=68.5∶10∶10∶5∶3.5∶1，V/V）将目标多肽从树脂上裂解下来并除去侧链保护基（30℃条件下切割3h）。滤液加入到大量冷的水/乙醚中进行萃取，水相冻干即得到多肽粗品。

多肽的纯化及表征，采用HP1200型反相高效液相色谱仪对合成肽粗品进行纯化。色谱柱型号：uiso C18（10 μm，100Å，50mm×250mm），色谱操作条件：流动相A为含0.05%三氟乙酸，2%乙腈的水溶液，流动相B为90%乙腈/水，流速25 mL/min，紫外检测波长220 nm。反复冻干去除溶剂后即得多肽纯品。纯度由分析型高效液相色谱仪给出。

1.3.8 呈味肽的呈味功能验证

（1）清水评价方法：将合成的多肽配制成0.1%浓度的水溶液，评价其风味强度、和谐性并进行整体风味特征描述，以了解多肽的基本味觉特性。并与目前报道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽作对比评价。

（2）鸡粉溶液加香评价方法：将合成的多肽配制成含0.05%肽、0.5%鸡粉、0.2%NaCl的水溶液，与空白、谷胱甘肽对比评价其在肉味、鲜度、醇厚感、酸味方面的呈味效果。

2 结果与分析

2.1 多肽的分离

2.1.1 柱分离洗脱液种类考察

将1.3.1中得到的酶解液，采用葡聚糖凝胶过滤柱法进行不同分子质量多肽的分离。以葡聚糖凝胶G25为填料填装层析柱，分别采用水、乙醇-水、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、NaCl-PBS四种洗脱液洗脱，单因素考察不同洗脱液的分离效果。利用自动馏分收集器进行级分收集，间隔时间为5 min，将收集到的不同级分经凝胶过滤色谱测定，将分子质量相近的级分合并，得到分子质量由高到低三个片段，记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再进行分子质量测定，评估分离效果，结果见表2。

本实验采用的葡聚糖凝胶填料Sephadex属于凝胶过滤层析填料，主要依据多肽的分子大小和形状进行分离，通常大分子物质先被洗脱出来，而后小分子被洗脱。由表2结果可知，4种洗脱液洗脱得到的Ⅲ组分分子质量均＜1000u，分离效果理想；组分Ⅰ中5 000 u以上部分含量增加较多，增加最多的（乙醇-水洗脱）可以由原液的39.2%提升至77.9%；组分Ⅱ中1 000～2 500 u和2 500～5 000 u含量较低，但1 000～5 000 u总体可达70%。可见，样品流经葡聚糖凝胶柱可以实现不同分子质量多肽的有效分离。从不同洗脱液的分离结果看，乙醇-水分离效果最优。

表2 不同洗脱液分离样品分子质量分布测定结果Table 2 Determination results of the molecular mass distribution separated by different eluents

2.1.2 柱分离填料考察

分别以G25、G15、G10为填料填装层析柱，在其他条件不变的情况下，单因素考察得到最适的填料种类。利用自动馏分收集器进行级分收集，间隔时间为5 min，将收集到的不同级分经凝胶过滤色谱测定，将分子质量相近的级分合并，得到分子质量由高到低三个片段，记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，再进行分子质量测定，评估分离效果，结果见表3。

表3 不同填料层析柱分离样品分子质量分布测定结果Table 3 Determination results of the molecular mass distribution separated by different packing chromatographic column

Sephadex填料是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒，商品化的Sephadex填料，按交联度不同，用Sephadex G加一个数字来区别型号，数字越小，表示介质交联度越大，分级范围越小，反之亦然。由表3结果也可证实，G15、G10的分级范围较小，仅能区分1 000 u以下的组分，对1 000～5 000 u之间组分的分离效果不佳，因此，本实验最终选取G25填料作为多肽分离填料。

2.2 不同分子量多肽的风味评价

2.2.1 感官评价

按照表1中基本配方，分别称取3.1中得到的＜1 000 u、1 000～5 000 u、＞5 000 u分子质量片段多肽以及未分离多肽、空白对比样，与其他原料一同进行美拉德反应，取样品进行感官评价及电子舌分析，结果见表4。

表4 肽粉反应产物的感官评价结果Table 4 Sensory evaluation results of reaction products of peptide powder

表4中评价结果显示，3#样品（分子质量＜1000u多肽的热反应产物）在醇厚感、嗜好性方面优于其他样品；2#样品（分子质量1 000～5 000 u多肽的热反应产物）在鲜度方面表现突出；1#样品（分子质量＞5 000 u多肽的热反应产物）在炖煮鸡肉香味方面表现更接近于未分离的混合多肽样品。可见，不同分子质量片段多肽提供的风味侧重点不同，其中分子质量＜1 000 u以下部分嗜好性最优，故将其作为下一步实验对象。

2.2.2 电子舌分析

图1 电子舌主成分分析Fig.1 Principal component analysis of electronic tongue

由图1可知，第一主成分（PC1）与第二主成分（PC2）的贡献率之和达到了99.654%，能很好地反映样品的实际情况。且全部样品的主成分分析的识别指数为91，说明不同样品能够很好地区分开来。5#清水样出现在图中最左侧，4#未分离酶解液样品出现在图中最右侧，1～3#样分布于其中，彼此差异明显，即5个样品风味差异较大。

表5 电子舌滋味强度分析Table 5 Analysis of taste intensity of electronic tongue

由表5可知，5个样品的鲜味、甜味、酸味强度普遍较高，咸味和苦味强度普遍较低；其中2#样品的鲜度最高，5个样品的鲜度强度排序为2#＞4#＞3#＞1#＞5#，与感官评价结果一致。3#样品的酸度最高；2#样品的甜度最高。即1 000～5 000 u肽段的美拉德反应产物鲜度、甜度最优；小于1 000 u肽段的美拉德反应产物酸度最优，适宜的酸度可以增加肉味感，这可能是小于1 000 u肽段在感官评价中嗜好性最优的因素之一。

2.3 呈味肽的纯化

利用反相高效液相色谱对嗜好性最优（分子质量＜1000u）的混合多肽样品进一步纯化，得到液相色谱图见图2，各峰保留时间及面积百分比见表6。

图2 混合多肽样品液相色谱图Fig.2 LC chromatogram of mixed polypeptide samples

表6 各吸收峰保留时间及面积百分比Table 6 Retention time and area percentage of each absorption peak

由表6可知，多肽含量最多的色谱峰为5#、6#峰，利用高效液相色谱仪自带的馏分收集器对5#、6#色谱峰进行收集，冻干后感官评价，评价结果显示，6#峰在嗜好性、和谐性方面明显优于5#峰，因此，以收集到的6#峰为研究对象，进一步进行分离与鉴定。

2.4 呈味肽的鉴定

利用液质联用仪对呈味肽进一步进行分离及成分鉴定，可检测到多种多肽，结合文献报道的氨基酸、多肽呈味效果，选择其中5条最有可能具有呈味贡献的多肽进行下一步固相合成。5条多肽的一级结构分别为γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-L-Val-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，其质谱鉴定结果如图3所示。

图35 条呈味肽质谱图Fig.3 Mass chromatogram of five flavor peptides

2.5 呈味肽的合成

目前，较为常用的多肽合成方法包括固相合成和液相合成法。相比于液相合成，固相合成法具有合成方便、迅速、纯度高等优势，已成为多肽合成的首选方法，为此，本实验采用固相合成法进行呈味肽合成。

采用反相高效液相色谱仪对合成肽粗品进行纯化，复冻干去除溶剂后即得多肽纯品，纯度由分析型高效液相色谱仪给出，均＞98%，产物可作为下一步风味验证试验的样品。

2.6 呈味肽的呈味功能验证

将合成的5条呈味肽以及目前报道中呈醇厚感最佳的谷胱甘肽（glutathione，GSH）进行清水评价，结果见表7。

由表7可知，合成的5条多肽，呈味效果基本以酸、甜、鲜味为主，这可能与其都以L-谷氨酸为氮端相关，而L-谷氨酸是典型的呈现酸味、鲜味的氨基酸。其中，γ-L-Glu-LVal-Gly与α-L-Glu-L-Val-Gly，这两条多肽的氨基酸序列完全相同，其区别仅为谷氨酸与缬氨酸之间形成肽键的羧基位置不同，但两者的呈味效果产生明显差异，表现为γ位的L-Glu-L-Val-Gly酸度高，略鲜甜、入口后唇舌感受到明显的收敛，而α位L-Glu-L-Val-Gly仅呈现较弱的酸味。由此可知，多肽的呈味功能不仅与其氨基酸序列相关，还与肽键的形成位置等空间结构相关。而化合物的空间结构直接影响其与味觉受体的结合与味觉响应，从而影响味感。

表76 种多肽感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of six poly peptides

由于不同呈味物质间的协同作用对呈味效果影响较大，单纯的清水评价无法充分体现物质味味相乘的作用，因此配置鸡粉溶液加香评价。合成的5条呈味肽与空白、谷胱甘肽对比评价结果见表8。

表86 种多肽的鸡粉溶液加香评价结果Table 8 Sensory evaluation results of six poly peptides in chicken powder solutions

由表8可知，6条多肽中，谷胱甘肽由于本身含有含硫氨基酸-胱氨酸，相比于其他多肽，其呈现出的肉味最强；呈现鲜味最强的多肽为γ-L-谷谷肽和γ-L-谷缬氨甘肽；呈现醇厚感最强的多肽依次为谷胱甘肽、γ-谷缬甘肽，与文献报道中γ-L-谷缬甘肽是L-谷胱甘肽醇厚感的12.8倍，是目前发现的醇厚感最强的多肽[28]不一致，可能与评价基质、多肽浓度、溶液pH有关，有待于今后进一步研究。

3 结论

本实验采用酶解法以鸡肉为原料进行鸡肉蛋白多肽的制备，通过葡聚糖凝胶柱层析法对混合多肽进行不同分子质量片断的分离，确定最优的分离填料为G25、洗脱液为乙醇-水，在此条件下，分子质量＜1 000 u组分含量可达100%、＞5 000 u含量达78%、1 000～5 000 u含量达70%。通过感官评价、电子舌分析发现，不同分子质量片段多肽提供的风味侧重点不同，分子质量＜1 000 u的多肽热反应产物在醇厚感、嗜好性方面最优。利用高效液相色谱、液质联用仪对该肽段进一步纯化与鉴定，找到其中5条呈味肽γ-L-Glu-L-Glu、γ-L-Glu-L-Asp、γ-L-Glu-L-Val、γ-L-Glu-LVal-Gly、α-L-Glu-L-Val-Gly，并采用固相合成法制备，经感官评价验证其呈味功能，发现在清水评价中，合成的5条多肽呈味效果以酸、甜、鲜味为主；在鸡粉溶液加香评价中，呈现鲜味最强的多肽为γ-L-Glu-L-Glu和γ-L-Glu-L-Val-Gly；呈现醇厚感最强的多肽依次为L-GSH和γ-L-Glu-L-Val-Gly。同时，实验证实多肽的呈味功能不仅与其氨基酸序列有关，还与肽键的形成位置等空间结构相关。多肽的氨基酸组成、序列以及空间结构与呈味之间的构效关系有待于进一步深入研究，以便为更多呈味肽的发现与应用，以及高品质香精、调味品的开发提供理论依据。

[1]OGASAWARA M,KATSUMATA T,EGI M.Taste properties of Maillard-reaction products prepared from 1 000 to 5 000 Da peptide[J].Food Chem,2006,99(3):600-604.

[2]LUCY Y.Peptides as flavor precursors in Maillard reaction[D].New Jersey:New Brun Swick Rutgers,2006.

[3]SUZUKI H,KAJIMOTO Y,KUMAGAI H.Improvement of the bitter taste of amino acids through the transpeptidation reaction of bacterial T-glutamyh ranspeptidase[J].J Agr Food Chem,2002,50(2):313-318.

[4]JSUZUKI H,KATO K,KUMAGAI H.Enzymatic synthesis of glutamylvaline to improve the bitter taste of valine[J].J Agr Food Chem,2004, 52(3):577-580.

[5]LIOE H N,TAKARA K,YASUDA M.Evaluation of peptide contribution to the intense umami taste of Japanese soy sauces[J].J Food Sci,2006, 71(3):277-283.

[6]林萌莉.鲜味肽功能及制备安全性研究[D].北京：北京理工大学，2016.

[7]HENDRICK M E,MITCHELL H L,MURRAY P R,et al.Features of alitameTMas a new high intensity sweetener[M].US:Springer-Verlag, 1996:226-239

[8]NOFRE C,TINTI J M.Neotame:discovery,properties,utility[J].Food Chem,2000,69(3):245-257.

[9]MATSUMOTO H,HIRATA K,SAKAMAKI N.Simultaneous determination of neotame,alitame and aspartame in foods by HPLC[J].J Food Hygien Soc Japan(Shokuhin Eiseigaku Zasshi),2008,49(1):31-36.

[10]STEVE A,SCHROEDER,WANG R.Stability enhancement of sweeteners using salts containing divalent or trivalent cations:European Patent,1274323 A1[P].2003-01-15

[11]MASUDA T,KITABATAKE N.Developments in biotechnological productionofsweetproteins[J].J Biosci Bioeng,2006,102(5):375-389.

[12]LI D F,JIANG P,ZHU D Y.Crystal structure of Mabinlin II:A novel structural type of sweet proteins and the mainstructural basis for its sweetness[J].J Struct Biol,2008,162(1):50-62

[13]BEHRENS M,MEYERHOF W,HELLFRITSCH C.Sweet and umami taste:naturalproducts,theirchemosensorytargets,andbeyond[J].Angew Chem Int Edit,2011,50(10):2220-2242.

[14]NEY K,NEY K H.Bitterness of peptides:amino acid composition and chain length[M].US:ACS Symposium Series,1979:149-173.

[15]MEDINA M,NUNMEZ M.Relationship between level of hydrophobic peptides and bitterness in cheese made from pasteurized and raw milk [J].J Dairy Res,1997,64:289-297.

[16]OTAGIRI K,NOSHO Y,SHINODA I,et al..Studies on a model of bitter peptides including arginine,proline and phenylalanine residues.I.Bitter taste of di-and tripeptides,and bitterness increase of the model peptides byextension of the peptide chain[J].Agr Biol Chem,1985,49(4):1019.

[17]TADA M,SHINODA I,OKAI H.L.Ornithyltaurine,a new salty peptide [J].J Agr Food Chem,1984,32(5):992-996.

[18]SEKI T,KAWASAKI Y,TAMURA M.Further study on the salty peptide ornithyl-beta-alanine,Some effects of pH and additive ions on the saltiness[J].J Agr Food Chem,1990,38(1):25-29.

[19]ZHU X L,WATANABE K,SHIRAISHI K.Identification of ACE-inhibitory peptides in salt-free soy sauce that are transportable across ca-co-2 cell monolayers[J].Peptides,2008,29(3):338-344.

[20]OKUMURA T,YAMADA R,NISHIMURA T,et al.Sourness-suppressing peptides in cooked pork loins[J].Biosci Biotechnol Biochem, 2004,68(8):1657-1662.

[21]KIMIZUKA A,UEDA Y,SAKAGUCHI M,et al.Flavor enhancing seasoning containing deodorized garlic extract and process:United States Patent,4741914 A[P].1988-05-03.

[22]UEDA Y,SAKAGUCHI M,HIRAYAMA K,et al.Characteristic flavor constituents in water extract of garlic[J].Agr Biol Chem,1990,54(1): 163-169.

[23]UEDAY,TSUBUKUT,MIYAJIMAR.Compositionofsulfur-containing components in onion and their flavor characters[J].Biosci Biotechnol Biochem,1994,58(1):108-110.

[24]UEDA Y,YONEMITSU M,TSUBUKU T.Flavor characteristics of glutathioneinrawandcookedfoodstuffs[J].Biosci Biotechnol Biochem, 1997,61(12):1977-1980.

[25]TOELSTEDE S,DUNKEL A,HOFMANN T,et al.A series of kokumi peptides impart the long-lasting mouthfulness of matured Gouda cheese [J].J Agr Food Chem,2009,57(4):1440-1448.

[26]DUNKEL A,KASTER J,HOFMANN T,et al.Molecular and sensory characterizationofγ-glutamylpeptidesaskeycontributorsto the kokumi tasteofediblebeans(PhaseolusvulgarisL.)[J].J Agr Food Chem,2007, 55(16):6712-6719.

[27]KOBAYASHI N,NISHIMURA O.Investigation of koku impact compounds in sweet cream on the basis of sensory evaluation and separation techniques[J].Food Sci Tech Res,2011,17(3):233-240.

[28]ROUDOT F,KERHOAS L,LEBARS D,et al.Isolation of 7-glutamyl peptides from Comte cheese[J].J Dairy Sci,1994,77(5):1161-1166.

Preparation,purification and identification of taste peptides

DENG Li,HAO Xuecai,LIU Na
(TianjinKeyLaboratoryofFlavorFoodIngredientsEnterprise,R&DCenter,TianjinChunfaBiotechnologyGroupCo.,Ltd.,Tianjin300300,China)

With chicken as raw material,the chicken protein polypeptides were prepared by enzyme hydrolysis method.According to the different molecular mass fragments,mixed polypeptides were separated by dextran gel column chromatography.The optimal separation filler was G25,the eluent was ethanol-water.Under the conditions,the content of components below molecular mass 1 000 u by separation and enrichment was up to 100%,above molecular mass 5 000 u up to 78%,and molecular mass 1 000-5 000 u up to 70%.The results of sensory evaluation and electronic tongue analysis showed that the polypeptides with different molecular mass fragments provided different taste profiles.The thermal reaction products of peptides that molecular mass was less than 1 000 u were superior in kokumi taste(mellow feeling)and preference.The polypeptides fragments were further purified and identified by HPLC and LC-MS.Five taste peptides were determined,and were prepared by solid-phase synthesis method.Their taste functions were verified by sensory evaluation.Results showed that the taste effect of five taste peptides synthesized was given priority to with sour,sweet and umami taste in the clear water evaluation.The peptides with strongest umami taste were γ-L-Glu-L-Glu and γ-L-Glu-L-Val-Gly,the peptides with strongest kokumi taste(mellow feeling)was L-GSH in the chicken powders solution evaluation

taste peptide;enzymatic hydrolysis;separation;purification;identification

TQ657

0254-5071（2017）04-0142-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.030

2017-01-19

邓莉（1981-），女，工程师，硕士，主要从事咸味食品香精基础研究工作。