太湖底泥中聚磷菌多样性的垂直分布

钱玮++朱艳霞++邱业先

摘要：以太湖不同深度底泥为研究对象，采用末端限制性片段长度多态性方法，分析底泥中聚磷菌的多样性。结果表明：32～35 cm底泥中聚磷菌多样性最高，物种丰度、Shannon-Weiner多样性指数分别为10、1.94。下层底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落结构趋于稳定，表层底泥（0～3、6～8 cm）受泥水界面影响，聚磷菌群落结构与下层底泥有明显差异。研究结果为了解湖泊底泥微生物的分布和聚磷菌多样性积累了有价值的资料。

关键词：太湖底泥；聚磷菌；末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）；垂直分布；微生物

中图分类号：X172文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2017）03-0221-03

收稿日期：2015-12-21

基金项目：苏州科技学院科研基金（编号：XKQ201313）。

作者简介：钱玮（1983—），男，江苏泰州人，硕士，实验师，研究方向为环境微生物学。Tel：（0512）68183945；E-mail：qianwei@mail.usts.edu.cn。

聚磷菌（polyphosphate accumulating organisms，简称PAOs）别称摄磷菌，是一类对磷超量吸收的细菌菌种，磷以聚磷酸盐颗粒（异染粒）的形式存在于细胞内，聚磷菌不是单一的微生物而是由不同的微生物群落组成[1]。研究表明，多聚磷酸盐在聚磷菌聚磷过程中起着关键作用。多聚磷酸盐（polyphosphate，简称Poly-P）是由无机正磷酸盐残基通过高能磷酸键连接而成的线性多聚物。近十年来，国外已有不少研究者对聚磷菌中与Poly-P的合成和分解有关的关键基因多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase，简称PPK）和外切聚磷酸酶（ex-opolyphosphatase，简称PPX）基因进行克隆表达，在国内相关研究刚刚起步，理解聚磷菌磷酸盐转运和代谢的生化机制和遗传学知识，试图从基因角度发现它们在遗传学和酶学上是如何调控的，对于改进聚磷菌的废水除磷能力是十分必要的[2]。

研究聚磷菌最传统的方法是分离培养法，但这种方法只能研究单一菌种特性，无法对生境中聚磷菌群落组成和动态变化进行综合分析，而分子生物学技术打破了传统的生物学方法存在的缺陷，使从宏观角度分析聚磷菌群落特征成为可能。本研究选用太湖竺山湖段生活污水入水口底泥为材料，采用基于PCR的分子指纹图谱技术——限制性末端片段长度多态性（terminal-restriction fragment length polymorphism，簡称T-RFLP）分析太湖生活入水口不同深度底泥聚磷菌群落多样性，旨在探究该地区底泥中聚磷微生物的群落结构，同时也为以微生物为基础的环境监测预警和评价提供理论依据[3]。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1样品采集

底泥样品于2012年5月29日采集，采样点位于太湖竺山湖（地理位置31°28′55″N，120°04′94″E）。以采样点为中心作边长10 m等边三角形，利用沉积物柱状采样器，从3个顶点采集0～50 cm深度底泥样品，把3份底泥样品分别按照0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度分成5段，将每段同一深度的底泥混匀，存放于-20 ℃冰箱待用[4]。

1.1.2试剂

PCR扩增试剂盒、DNA胶回收试剂盒、限制性内切酶TaqⅠ、PCR引物等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3仪器

GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、5417R小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）、Universal Hood Ⅱ凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad）、5332PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）、HHoS21-4-S恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、YXQ-LS-50SII高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1底泥DNA提取

底泥总DNA提取参照朱艳霞等的方法[5]，略有改动。称取3 g底泥样品于10 mL离心管中，加入6 mL DNA提取液，涡旋混匀5 min。加入溶菌酶至终浓度为2 mg/mL，摇床37 ℃、225 r/min振荡1 h。加入10%体积20%十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，简称SDS），混匀后于65 ℃水浴2 h，其间每15 min轻轻颠倒混匀。室温 8 000 r/min 离心10 min收集上清，上清中加50%体积的40%聚乙二醇-8 000（polyethylene glycol，简称PEG）混匀，4 ℃ 沉淀过夜。4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集沉淀。沉淀用600 μL TE缓冲液溶解，加入等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集上清。加入等体积的三氯甲烷-异戊醇（24 ∶[KG-*3]1），4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，收集上清。加入10%体积的 5 mol/L 乙酸钠和60%体积-20 ℃预冷的异丙醇室温沉淀 4 h，4 ℃、12 000 r/min离心15 min弃上清。沉淀用 -20 ℃ 预冷的70%乙醇洗涤2次，沉淀晾干后加200 μL TE缓冲液溶解，收集于1.5 mL离心管中。[JP2]

1.2.2聚磷菌的PCR扩增

PCR上游引物PPK1（5′-FAM-[JP]AAYYTNGAYGARTTYTTYATGGT-3′），PCR下游引物PPK2（5′-GTCGAGCAGTTTTTGCATGA-3′）。PCR反应为20 μL体系：10 μL 2×Premix，各1 μL上下游引物，1 μL模板DNA，7 μL ddH2O。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，48.5 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min[6-7]。

1.2.3PCR產物的纯化与限制性酶切

按照说明书，使用DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物。采用TaqⅠ限制性内切酶同时对PCR产物进行酶切。限制性酶切体系包含PCR纯化产物10 μL，10×buffer （TaqⅠ） 1 μL，TaqⅠ酶1 μL。65 ℃ 酶切4 h后将产物送上海基康生物技术有限公司进行基因扫描。

1.2.4数据分析

T-RFLP图谱分析采用Treeflap软件[8]，峰值图上峰的横坐标代表T-RF的片段长度；峰的面积则代表具有相同片段长度所有T-RF的荧光强度的总和，即它所代表的这种菌种的相对丰度，然后分别计算样本的物种丰度（species richness）、多样性指数（Shannon-Weiner index）、优势度指数（Simpson index）和均匀度指数（Pielou evenness）。样品聚类分析使用SPSS 15.0软件。

2结果与分析

2.1聚磷菌的PCR扩增

以不同深度底泥提取的基因组DNA为模板，采用针对聚磷菌的PPK特异性引物进行扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，获得了长度约为600 bp的目的条带（图1）。

2.2聚磷菌T-RFLP图谱分析

PCR产物经双酶切后进行基因扫描，得到0～3、6～8、12～15、22～25、32～35 cm深度底泥聚磷菌群落多样性T-RFLP图谱（图2）。T-RFLP图谱用Treeflap软件进行分析，选择的内标为GS500liz和sizing defalt-pp，舍去小于35 bp和大于500 bp的片段，取荧光强度大于1 000 RFU的峰，得到不同深度底泥优势菌群的种类及数量（图3）。[FL）]

从图2、图3中可以看出，不同深度底泥中聚磷菌种类不同，检测到的T-RFs片段长度主要集中在35～43 bp和 177～186 bp段。179 bp所代表的聚磷菌在所有样品中普遍存在，且在各样品中含量基本相当。35～43 bp段所代表的微生物存在于0～3、22～25、32～35 cm等3个深度底泥样品中，在6～8、12～15 cm深度的底泥中未能检测到。180 bp所代表的聚磷菌存在于除去0～3 cm段的其他4个深度的样品中，且在各样品中比例较大，可能是因为该聚磷菌能够稳定地存在于底泥中，但其生长受水体影响较明显，无法存在于最表层底泥中。

2.3不同深度底泥聚磷菌多样性比较分析

根据不同深度底泥聚磷菌群落丰度（图4-A）可以看出，不同深度的底泥中聚磷菌数量差异不大，底层和表层泥中聚磷菌种类相对较丰富。从Shannon-Weiner指数（图4-B）可以看出，最底层聚磷菌群落多样性最大，群落最复杂；0～15 cm段随着深度的增加，聚磷菌多样性减少，而15～35 cm 多样性逐渐增多。均匀度（Pielou）指数表明，不同深度底泥聚磷菌群落均一性差异明显，0～8 cm段聚磷菌均一性随着深度的增加而增强，8～35 cm段聚磷菌均一性随着深度增加而减弱（图4-C）。Simpson指数表明，不同深度聚磷菌群落优势度存在明显的差异，其中12～15 cm深度处聚磷菌的Simpson指数最高，说明该点的不同聚磷菌丰度相差不大，而深层底泥中聚磷菌分布极不均匀（图4-D）。[FL）]

[FK（W18][TPQW4.tif][FK）]

2.4聚磷菌群落结构的聚类分析

对5个不同深度底泥的T-RFLP图谱进行聚类分析，由图5可以看出，12～15、22～25、32～35 cm聚类为1组，它们所含聚磷菌群落结构相近，与0～3、6～8 cm段样本的相似度较差。这一结果也从侧面反映了不同深度的底泥样品中聚磷菌群落结构与细菌群落结构的变化具有一致性[9]。

3结论与讨论

太湖底泥中最底层聚磷菌种类、多样性最多，分别为10、1.94，群落较复杂。不同深度聚磷菌群落优势度和均匀度存在明显的差异，其中15 cm深度处聚磷菌种类分布比较均一，而深层底泥中聚磷菌丰度差异性逐渐增大。各样品中 T-RFs 片段长度主要集中在35～43、177～186 bp段，难以进行区分。可能原因是PPK引物扩增得到DNA片段中有较长的保守序列，使得酶切片段比较集中，后续可以尝试更换引物以及通过双酶切以增加T-RFs多样性[10]。

通过聚类分析发现，下层底泥（12～15、22～25、32～35 cm）中聚磷菌的群落结构趋于稳定，与0～3、6～8 cm段样品所含聚磷菌种类相似度较差，可能原因是表层底泥位于泥水界面，其中磷的含量和形态变化受泥水界面扰动较大，由此造成其中聚磷菌群落结构与底层差异较大[11]。

[HS2*3]参考文献：

[1]Acevedo B，Oehmen A，Carvalho G，et al. Metabolic shift of polyphosphate-accumulating organisms with different levels of polyphosphate storage[J]. Water Research，2012，46（6）：1889-1900.

[2]Majed N，Du Y，Gu A Z. Analysis of phosphorus fractions in EBPR process and metabolic link with polyphosphate[J]. Proceedings of the Water Environment Federation，2010（9）：7109-7116.

[3]Disayathanoowat T，Young J P W，Helgason T，et al. T-RFLP analysis of bacterial communities in the midguts of Apis mellifera and Apis cerana honey bees in Thailand[J]. FEMS Microbiology Ecology，2012，79（2）：273-281.

[4]袁和忠，沈吉，刘恩峰，等. 太湖水体及表层沉积物磷空间分布特征及差异性分析[J]. 环境科学，2010，31（4）：954-960.

[5]朱艳霞，邱业先，钱玮. 一种适用于太湖底泥基因组DNA的提取方法[J]. 江苏农业科学，2012，40（7）：31-33.

[6]McMahon K D，Jenkins D，Keasling J D. Polyphosphate kinase genes from activated sludge carrying out enhanced biological phosphorus removal[J]. Proceedings of the Water Environment Federation，2001（16）：20-33.

[7]McMahon K D，Yilmaz S，He S，et al. Polyphosphate kinase genes from full-scale activated sludge plants[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，77（1）：167-173.

[8]Antunes P M，Koch A M，Dunfield K E，et al. Influence of commercial inoculation with Glomus intraradices on the structure and functioning of an AM fungal community from an agricultural site[J]. Plant and Soil，2009，317（1/2）：257-266.

[9]朱艷霞. 太湖入水口底泥微生物宏基因组及聚磷菌多样性研究[D]. 苏州：苏州科技学院，2012.

[10][JP2]王荻，徐革锋，刘洋，等. 两种双酶切组合在细鳞鱼AFLP体系中的比较分析[J]. 大连海洋大学学报，2009，24（5）：459-464.[JP]

[11]李大鹏，黄勇，李伟光，等. 底泥扰动对上覆水中磷形态分布的影响[J]. 环境科学学报，2009（2）：279-284.