风味发酵乳中三氯蔗糖含量的测定

周玉莹++叶益微++涂满标++王晶

摘 要：建立风味发酵乳中三氯蔗糖含量的测定方法，并对国标法的前处理进行优化。采用高效液相色谱仪-蒸发光散射检测器，Agilent ZORBAX SB-C18（150mm*4.6mm，5μm）色谱柱，柱温：40℃，流速：1ml/min，流动相：水：乙腈=85：15（V/V），蒸发管温度：50℃，气体流量2.0ml/min，放大倍数：1倍。采用此方法，工作曲线线性范围：0.1-0.8mg/ml，相关系数：R2=0.9995，回收率：92%-95%，精密度（n=6）：0.85%，方法快速、准确，可以适用于风味发酵乳中三氯蔗糖含量的检测。

关键词：三氯蔗糖；高效液相色谱；蒸发光散射检测器；风味发酵乳

中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）05-0195-02

三氯蔗糖（TGS），又称蔗糖素、蔗糖精。三氯蔗糖是以蔗糖为原料经氯化作用而制得的，外观为白色粉状晶体，甜味特性非常接近蔗糖，甜度是蔗糖的600倍，极易溶于水、乙醇和甲醇，微溶于乙酸乙酯。由于它能量低，是肥胖症、心血管病和糖尿病患者理想的甜味剂[1]。我国卫生部2014年发布的《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定，三氯蔗糖在风味发酵乳中最大允许使用量为0.3g/kg[2]。GB22255-2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖的测定》中推荐高效液相色谱仪与示差检测器或蒸发光散射检测器配合使用检测食品中三氯蔗糖的含量[3]，但方法中步骤过于繁琐，同时造成回收率偏低[4-8]。本实验针对国标中前处理方法进行了优化，改进后的实验方法能够快速、准确的测定风味发酵乳中三氯蔗糖的含量。

1 材料与方法

1.1 试剂和标准品

乙腈（色谱纯）、超纯水、乙酸铅、三氯蔗糖标准品。

1.2 仪器

安捷伦高效液相色谱仪1260、格雷斯蒸发光散射检测器ELSD3300、涡旋式混合器、高速离心机、超声波清洗器、IKA旋转蒸发仪。

1.3 色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXSB-C18柱子（150mm*4.6mm，5μm）。

进样体积：20μL，流速：1ml/min，柱温：40℃，流动相：水：乙腈=85：15（V/V）。

蒸发光散射检测器条件：蒸发管温度：50℃，气体流量2.0ml/min，放大倍数：1倍。

1.4 样品前处理

称取5g风味发酵乳样品于50ml离心管中，加入5ml水，涡旋混合器上震荡30s。加入15ml乙腈和2ml乙酸铅（22g/L），震荡30s，超声30min。以7000r/min离心5min，将上清液移至鸡心瓶中，沉淀物中加入10ml75%乙腈水溶液，涡旋震荡混合均匀，以7000r/min离心5min，重复提取2次，将上清液合并至鸡心瓶中。在旋转蒸发仪上用70℃水浴蒸干，残渣用3ml超纯水溶解，置于5ml容量瓶内定容，静置后溶液过0.45μm水系滤膜，滤液上机检测。

1.5 测定

1.5.1 三氯蔗糖标准贮备液配制

准确称取50mg三氯蔗糖标准品于50ml容量瓶中，用水定容至刻度，混合均匀，此时三氯蔗糖浓度为1mg/ml，储备液置于4℃冰箱中保存。

1.5.2 三氯蔗糖标准工作液配制

吸取1ml、2ml、5ml、8ml三氯蔗糖标准贮备液于10ml容量瓶中，用水定容至刻度，混合均匀，此时三氯蔗糖的标准工作液的浓度分别为0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.5mg/ml，0.8mg/ml。三氯蔗糖标准品的色谱图如图1。

1.5.3 样品测定

取前处理后的滤液20μL进样，进行高效液相色谱分析，通过保留时间确定三氯蔗糖的色谱峰，根据外标法用峰面积进行定量分析。三氯蔗糖样品溶液色谱图如图2。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

本实验中采用乙腈与乙酸铅配合作为风味发酵乳的蛋白沉淀剂，国标法中使用的是甲醇，乙酸锌-亚铁氰化钾混合沉淀剂，对比来看，乙腈比甲醇对蛋白质的沉淀效果更好，乙酸锌-亚铁氰化钾作为沉淀剂会造成基线波动，整个色谱系统不稳定，同时会引入杂质峰，因此选用对基线影响较小的乙酸铅作为沉淀剂。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 流动相的选择

实验中采用了不同体积比的水-乙腈对样品进行分离，结果表明，水-乙腈（85：15，V/V）为流动相时，三氯蔗糖在7min内出峰并且能够与杂质峰得到有效的分离，峰形比较理想。

2.2.2 温度的选择

实验中有两部分温度的设置，一部分是柱温箱的温度，此处设置了40℃，给样品溶液和流动相一个预加热，以便于后续到达蒸发管后能够快速的蒸发。另一部分蒸发管的温度设置为50℃，由于流动相中是高含水量的流动相，因此相应的蒸发温度会比高有机流动相的高，保证气溶胶中挥发性成分在加热的不锈钢漂移管中完全蒸发。

2.3 回归方程与相关系数

根据蒸发光散射检测器原理，以三氯蔗糖浓度的log对数（X）为横坐标，峰面积的log对数（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到对数方程：Y=1.3796X+3.9584，相关系数为0.9995。

2.4 精密度试验

同一样品在相同条件下连续分析6次，测定结果如表1，其相对标准偏差RSD为0.85%。

2.5 回收率试验

取风味发酵乳样品进行加标回收率实验，结果如表2所示。

3 结语

本实验建立了风味发酵乳中三氯蔗糖的检测方法，并优化了蛋白沉淀剂，流动相比例以及蒸发管温度，有效的减少了雜质对三氯蔗糖色谱峰的干扰，同时提高了实验效率，使得三氯蔗糖样品分离在7min内能够完成。综上所述，本实验方法可以应用于风味发酵乳中三氯蔗糖的测定。

参考文献

[1]胡莉蓉.新型甜味剂三氯蔗糖[J].化工时刊，2005，19（3）：50-55.

[2]GB2760-2014，食品添加剂使用标准[S].

[3]GB/T22255—2008食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定[S].

[4]粟晖，韦异，张英，等.反相高效液相色谱法分离测定三氯蔗糖[J].食品工业科技，2002，23（6）：66-67.

[5]熊丽蓓，戴承兵，何倩琼.高效液相色谱法测定食品中三氯蔗糖含量的研究[J].上海预防医学杂志，2005，17（4）：156-158.

[6]KOBAYASHI C，NAKAZATO M， YAMAJIMA Y，et al.Determination of sucralose in foods by HPLC[J].Shokuhin Ei-seigaku Zasshi，2002，42（2）：139-143.

[7]KISHI H， KAWANA K. Determination of sucralose in foods by anionexchange chromatography and reverse -phase chromatography[J].Shokuhin Eiseigaku Zasshi， 2001，42（2）：133-138.

[8]鲁琳，杭义萍，高燕红，等.高效液相-蒸发光检测器测定食品中的三氯蔗糖[J].中国热带医学，2008，8（9）：1628-1629.