沙棘和文冠果油体蛋白提取及双向电泳分析

李荣荣，阮成江，马 倩，杜 维

(大连民族大学 资源植物研究所，辽宁 大连116600)

油料蛋白

沙棘和文冠果油体蛋白提取及双向电泳分析

李荣荣，阮成江，马 倩，杜 维

(大连民族大学 资源植物研究所，辽宁 大连116600)

从沙棘果肉和文冠果种仁中提取油体蛋白，并进行双向电泳分析。结果表明：沙棘果肉和文冠果种仁的油体蛋白相对分子质量主要集中在10～60 kD之间；沙棘果肉油体蛋白双向电泳图谱至少含有281个蛋白点，文冠果种仁油体蛋白则至少含有248个蛋白点，两种木本油料的酸性蛋白点均多于碱性蛋白点，且蛋白点主要集中在等电点4.0～7.0之间。实验结果为进一步对沙棘和文冠果的油体蛋白质组学研究提供依据和基础。

沙棘；文冠果；油体；油体蛋白；双向电泳

油体是植物的储油细胞器[1]，其大小与分布直接影响器官含油量。油体外部包被一层磷脂和蛋白质镶嵌而成的半单位膜，油体膜及膜上附着的蛋白占油体质量的1%～4%，脂肪酸以三酰甘油的形式储存在膜内。油体蛋白中约90%为油质蛋白(oleosins)，少量为油体钙蛋白(caleosin)等其他蛋白，它们共同参与油体结构的建成和生物学功能，并在油体的形成、稳定及油脂代谢利用过程中发挥着关键作用[2-7]。近20年来对油体及油体蛋白的研究趋于多样性，齐玉红等[2]研究了大豆、花生等不同作物油体的性质，曾艳玲等[7]研究了芝麻、花生等作物油体蛋白组分含量的比较及温度对油体储存的影响。

沙棘和文冠果是北方重要的木本油料，抗旱、耐瘠薄，在我国北方防沙治沙、干旱半干旱区生态建设和退耕还林中被大面积推广[8-10]。但到目前为止对沙棘和文冠果油脂的合成机制仍不清楚。本研究从沙棘果肉和文冠果种仁中提取油体蛋白，并使用双向电泳方法对其进行分析，不仅有助于了解这两种木本油料油体蛋白的组成、种类和理化性质，也可为进一步对这两种木本油料的油脂合成及其蛋白调控的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

沙棘：实优一号，果实采自大连民族大学校园内沙棘林，采摘后在低温环境下用解剖刀将其果肉和种子进行分离，果肉冷冻备用。文冠果：东兰一号，采自内蒙古赤峰，破壳处理后将种仁冷冻备用。

KCl， MgCl2，蔗糖， 石油醚，氯仿，丙酮，尿素，琼脂糖，甘氨酸，过硫酸铵，考马斯亮蓝G-250，磷酸铵，磷酸(优级纯，科密欧)；EDTA，DTT，SDS，硫脲，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，IAM(阿拉丁)；CHAPS(进口)；Tris-HCl(生工)；甲醇(色谱纯，科密欧)；Bio-Lyte(Bio-Rad)；标准牛血清蛋白(美国MP公司)；GMI(1 mmol/L EDTA，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT,0.6 mol/L蔗糖,0.15 mmol/L Tricine-KOH,pH 7.5)；FMI(0.4 mol/L蔗糖，其他成分与GMI相同)；GMII(GMI+2 mol/L NaCl);FMII(FMI+2 mol/L NaCl)

1.1.2 仪器与设备

UH5300型分光光度计(Hitachi),PROTEANi12型等电聚焦仪(Bio-Rad),GS-900型校准光密度仪(Bio-Rad),ProteanII XLCell垂直板电泳仪(Bio-Rad)，IPG胶条(11 cm，pH 4～7，Bio-Rad),涡旋振荡器(上海昕仪),微波炉(Midea),摇床,紫外分光光度计,离心机，双向电泳系统。

1.2 实验方法

1.2.1 油体分离

[11-13]的方法。取6 g左右冷冻备用的沙棘果肉或文冠果种仁，液氮下充分研磨成粉末，按如下步骤操作：①加入15 mL GMI，再加入15 mL FMI，4℃、10 000g条件下离心30 min。②取上层油层将其重悬于15 mL GMII，加入15 mL FMII，如上条件离心。③重复步骤①。④取上层油层重悬于15 mL GMII溶液，室温振荡30 min，悬浮液如上条件离心。⑤重复步骤①。最终将得到的油体悬浮于GMI溶液，4℃保存备用。

1.2.2 油体蛋白提取

取已分离的沙棘果肉油体或文冠果种仁油体2 mL，加入等体积的石油醚，振荡，13 000g、4℃条件下离心5 min，用移液枪去除上层的石油醚相。重复以上实验2次以上，直至上层石油醚相颜色变淡，然后氮气喷射除去残余的石油醚。加入3 mL氯仿-甲醇(体积比2∶1)，振荡，如上条件离心。用移液枪去除上层和下层液相，将富含蛋白的中间层重悬于1 mL水，加入3 mL氯仿-甲醇(体积比2∶1)，振荡，如上条件离心。重复以上实验3次。最终，将中间层蛋白重悬于2 mL水，超声波处理5 min。加入4倍体积的冷丙酮，于-20℃沉淀16 h以上，然后13 000g离心20 min，再加入冷丙酮清洗2～3次，如上条件离心，所得蛋白沉淀冻干备用[11-13]。

1.2.3 油体蛋白的SDS-PAGE

改进齐玉红等[2]的油体蛋白SDS-PAGE电泳方法。取经上样缓冲液处理后的蛋白样品，每孔加样10 μL，用12%分离胶进行SDS-PAGE电泳分离，每块胶的电流强度为20 mA，10 min后改为60 mA，直至样品达到胶板底部，结束电泳；后用考马斯亮蓝G250染色2 h，脱色，拍照观察。

1.2.4 油体蛋白的双向电泳分析

1.2.4.1 等电聚焦

取冻干备用的蛋白干粉，用蛋白裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、0.2% Bio-Lyte)裂解，采用Bradford法[14]测定样品中蛋白质含量，以确保上样量。从-20℃冰箱取出IPG胶条，室温放置10 min。用移液枪沿着水化盘槽的边缘由左到右加入样品(0.6 g/L，200 μL)，用镊子轻轻去除IPG胶条上的保护层，将胶条覆盖于样品之上，胶条标有“+”号一端对应水化盘的正极。在胶条上覆盖2 mL的矿物油后采用主动水化，条件为50 V、17℃、12 h，等电聚焦具体参数见表1。每根胶条的最大电流设置为50 μA。

表1 等电聚焦参数

1.2.4.2 胶条平衡

等电聚焦结束后取出胶条，用滤纸吸取矿物油，加入平衡缓冲液I(5 mL平衡缓冲母液+0.1 g DTT)进行第一次平衡，时间为15 min；用滤纸吸取胶条上多余的平衡缓冲液I，加入平衡缓冲液II(5 mL平衡缓冲母液+0.125 g IAM)进行第二次平衡，时间为15 min。胶条平衡缓冲母液：6 mol/L尿素、2% SDS、0.375 mol/L pH 8.8 Tris-HCl、20%甘油。

1.2.4.3 SDS-PAGE

平衡结束后，用滤纸吸去多余的平衡缓冲液，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液(25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS)中。将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上，加入封胶液(0.5% 琼脂糖、25 mmol/L Tris、192 mmol/L甘氨酸、0.1% SDS、0.001% 溴酚蓝)，避免胶条与胶面之间产生气泡。待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中，并加入1×电泳缓冲液，接通电源，使进胶条件为10 mA/胶，分离条件为20 mA/胶。待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。

1.2.4.4 染色与脱色

采用Neuhoff考染法[15]。双向电泳结束后用固定液对凝胶固定2 h，然后用染色液染色24 h，染色结束后用去离子水水洗3次，每次10 min。

1.2.4.5 图像扫描与分析

用GS-900型校准光密度仪进行扫描拍照(同种样品不同次)，用PDQuest 8.0 软件对所得图像进行分析。

2 结果与讨论

2.1 油体提取

分离出的沙棘果肉和文冠果种仁的油体见图1。

图1 沙棘果肉(a)和文冠果种仁(b)的油体

由图1可看出，沙棘果肉和文冠果种仁的油体的基本形态均为圆形或椭圆形，沙棘果肉的油体分布较文冠果种仁分散，且体积较小(见图1方框中)，同时还存在黄色较大的圆形或不规则形状的非油体物质。

2.2 油体蛋白的SDS-PAGE

将蛋白干粉溶解于上样缓冲液中，做SDS-PAGE，结果如图2所示。

图2 沙棘果肉(1)和文冠果种仁(2)油体蛋白的SDS-PAGE

由图2可看出，沙棘果肉和文冠果种仁的油体蛋白主要集中在10～60 kD之间，均得到8、12、25 kD和35 kD左右4条明显的油体蛋白带，文冠果油体高表达蛋白相对集中，沙棘油体蛋白相对分子质量分布较广。

2.3 油体蛋白的双向电泳

经双向电泳对沙棘果肉和文冠果种仁油体蛋白进行多次实验与分析获得了蛋白点丰富、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱，见图3、图4。

图3 沙棘果肉油体蛋白双向电泳分析

图4 文冠果种仁油体蛋白双向电泳分析

由图3可看出，沙棘果肉油体蛋白双向电泳图谱至少含有281个蛋白点，其中酸性蛋白点明显多于碱性蛋白点，蛋白点主要集中在等电点4.0～7.0之间，对重复实验得到的双向电泳图谱进行重复性分析，得出其匹配率达到88%，相对分子质量在13～30 kD、等电点在5.5～7.0之间的蛋白分布相似，相对分子质量在50～97 kD、等电点在5.0～7.0之间的蛋白分布相似，图3中圆圈的酸性区域蛋白点存在一定差异。

由图4可看出，文冠果种仁油体蛋白双向电泳图谱至少含有248个蛋白点，同样酸性蛋白点多于碱性蛋白点，蛋白点主要集中在等电点4.0～7.0之间，文冠果含油量多且含糖量低，油体提取较沙棘容易且得到的蛋白杂质少，重复实验蛋白点分布基本一致。

2.4 讨论

样品制备是蛋白质组学研究中最为基础和重要的步骤，样品制备的好坏可以从双向电泳结果得以直观的体现[16-17]。本研究的蛋白样品是在分离获得油体的基础之上提取的，由于油体蛋白大多具有一部分疏水区域，提取与电泳分析较困难，本研究所获得的油体状态与之前报道的油菜籽、水稻、黑豆、红花、芝麻等[1-2，7]的油体状态相符，但本研究的沙棘油体图像中显示出黄色较大的圆形或不规则形状的非油体物质，这是由于沙棘本身含油量少且含糖量较高，分析此物质是糖类等和未能分离的果肉物质与油体形成的聚合物。同时，沙棘油体蛋白双向电泳图的酸性端区域出现拖尾，这主要是因为样品中带负电荷的杂质较多，等电聚焦中聚集到酸性端附近造成酸性端聚焦不完全形成的。相对分子质量为15～24 kD[3]的油质蛋白在油体蛋白中最为丰富，据此推测图3、图4方框内某点为小分子油质蛋白，未来将对此处蛋白点做质谱分析。

3 结 论

本研究从沙棘果肉和文冠果种仁中提取油体蛋白，并进行双向电泳分析。结果发现，沙棘果肉和文冠果种仁的油体蛋白主要集中在10～60 kD之间；沙棘果肉油体蛋白双向电泳图谱至少含有281个蛋白点，对其进行重复性分析匹配率达88%，文冠果种仁油体蛋白则至少含有248个蛋白点，重复实验的蛋白点分布基本一致，两种木本油料的酸性蛋白点均多于碱性蛋白点，且蛋白点主要集中在等电点4.0～7.0之间。

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Extraction and two-dimensional electrophoresis analysis of oil body proteins from seabuckthorn and yellow horn

LI Rongrong, RUAN Chengjiang, MA Qian, DU Wei

(Institute of Plant Resources,Dalian Nationalities University, Dalian 116600, Liaoning,China)

Oil body proteins were respectively extracted from seabuckthorn pulp and yellow horn kernel, and analyzed by two-dimensional electrophoresis. The results showed that the relative molecular weights of oil body proteins from seabuckthorn pulp and yellow horn kernel were mainly in the range of 10-60 kDa; two-dimensional electrophoresis could present the ideal picture of oil body proteins, in which 281 protein spots were found from oil body protein in seabuckthorn pulp and 248 protein spots were found from oil body protein in yellow horn kernel, respectively. The acidic protein spots of these two woody oil plants were more than alkaline protein spots, and the isoelectric points of most protein spots ranged from 4.0 to 7.0. The results provided scientific base for oil body proteomics of seabuckthorn and yellow horn.

seabuckthorn; yellow horn; oil body; oil body protein; two-dimensional electrophoresis

2016-06-01;

2016-11-17

国家自然科学基金(13570681)；国家“十二五”农村领域科技支撑计划专题(2015BAD07B0106)

李荣荣(1990)，女，硕士研究生，研究方向为植物蛋白质组学(E-mail)lirongrong201507@163.com。

阮成江，教授，博士(E-mail)ruan@dlnu.edu.cn。

TQ936.2;O657

A

1003-7969(2017)02-0089-04