枸杞棉蚜SSR—PCR反应体系的建立与优化

李琳琳+严林+王海春+李成洁+冶成祥+谢永丽

摘要：采用单因素法和L25（55）正交试验设计进行简单重复系列PCR（SSR-PCR）反应体系优化，并对引物退火温度进行筛选，以建立适宜枸杞棉蚜的SSR反应体系和扩增程序。结果表明，枸杞棉蚜SSR-PCR的优化体系总体积为25 μL，包括50 ng模板DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，150 μmol/L Mg2+，300 μmol/L dNTPs，0.4 pmol/μL引物，优化后的检测体系更为经济有效；Ago66引物PCR适宜退火温度为58 ℃。

关键词：棉蚜；SSR；单因素试验；正交优化

中图分类号： S435.671文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0040-04

运用分子生物学技术研究蚜虫已经成为热点问题[1]，棉蚜的分子生物学研究多集中于棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜，国内学者孟玲等初步应用随机扩增多态性DNA（RAPD）研究黄瓜寄主和棉花寄主的棉蚜遗传多样性，奠定了一定的基础[2-3]。邹晨辉等采用简单重复序列（SSR）初步研究了不同地理及季节的棉花型棉蚜遗传多样性[4-6]。国外学者Fuller等运用SSR技术研究了欧洲、非洲、美洲、亚洲等地区多个国家的棉蚜遗传多样性，这些棉蚜原寄主涉及棉花、葫芦科、棉花、茄子、马铃薯、辣椒、花椒、梨树和柑橘树[7-9]。枸杞是重要的药用经济作物，棉蚜危害严重，国内外尚缺少对原寄主是枸杞的棉蚜分子生物学方面的研究资料。

微卫星DNA是短的碱基重复序列，最早在寄居蟹中被发现[10]，在真核生物中广泛存在，由于点突变、不等交换、基因转换等原因，使其变异速率高，因此具有高的多样性及种特异性[11]。微卫星分子标记是基于PCR的第二代分子标记技术[12]，具有重复性好、多态性高、共显性、所需DNA量少、操作简单等优点。正是由于微卫星分子标记是基于PCR的，因此优化的PCR体系与扩增条件是微卫星分子标记的前提条件。

单因素试验无法考虑到因素之间的交互作用，正交试验无法分析因素的影响趋势，本研究综合以上2种方法，弥补不足，以枸杞棉蚜为材料，对DNA用量、Taq聚合酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个因素进行优化，建立枸杞棉蚜SSR-PCR试验的最佳反应体系，并在此基础上得到引物的最适退火温度。本试验探讨枸杞棉蚜种群遗传多样性研究中 SSR-PCR方法的一致性、可靠性和可重复性，为枸杞棉蚜种群遗传多样性分析、生物型鉴定、指纹图谱构建等研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料材料采于青海诺木洪红枸杞栽培田，采集无翅棉蚜成虫，样品单头分别放于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中浸泡，于-20 ℃保存备用。

1.1.2试剂试验所用试剂10×PCR Buffer（无Mg2+）、dNTPs（2.5nmol/μL）、MgCl2（25.0nmol/μL）、Taq DNA 聚合酶（5.0 U/μL）等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。200 bp DNA Marker，购自TaKaRa公司。SSR引物采用Vanlerberghe-Masutti等于1999年设计的棉蚜微卫星引物（表1）[13]，正交试验所用引物为Ago66，引物Ago59和Ago89為体系验证引物，均为生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1枸杞棉蚜总DNA提取及检测采用杨子祥等的改进SDS法[14]提取枸杞棉蚜基因组DNA，用核酸微量测定仪（德国Eppendorf公司BioSpectrometerbasic型）检测DNA的浓度和质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，将提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.2.2因素设计方案本试验设定的标准反应体系：反应总体积为25μL，其中含有80 ng模板DNA、2.5 U Taq酶、150 μmol/L Mg2+、250 μmol/L dNTPs、1.2 pmol/μL引物。为比较不同处理对SSR扩增的影响，采用单因素体系优化试验对影响扩增的Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物分别设置5种梯度水平。即当一种成分浓度梯度变化时，其他成分不变。其中DNA模板的梯度设计为20、40、60、80、100 ng；Taq酶的梯度设计为0.5、1、1.5、2、2.5 U；Mg2+的梯度设计为150、175、200、225、250 μmol/L；dNTPs的梯度设计为100、150、200、250、300 μmol/L；引物的梯度设计为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 pmol/μL。加ddH2O补足体积为25 μL。

1.2.3正交优化设计为探讨反应因素间的互作效应，PCR扩增所设置因素的水平同单因素试验一致，采用L25（55）正交试验设计（表2）。为提高试验准确性，正交试验进行1次重复检验。

1.2.4SSR-PCR扩增及产物检测PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，35次循环；72 ℃ 5 min。4 ℃保存备用。PCR扩增产物用8%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，用 DL200 Marker 作为标准分子量参照物，恒压180 V电泳约1 h，经固定、银染、显色和漂洗后，数码相机拍照观察。

参照何正文等的方法[15]，依据扩增条带的敏感性和特异性进行计分，分数越高表示扩增带的敏感性、特异性越好。

1.2.5PCR扩增程序退火温度的筛选在确定最佳反应体系的基础上，对引物Ago66的退火温度在Tm值上下设置5个温度梯度进行筛选。

1.2.6SSR最佳反应体系的验证 利用引物Ago59和Ago89验证此反应体系的可行性及稳定性。

2结果与分析

2.1DNA提取

用改进的十二烷基硫酸钠（SDS）法提取的枸杞棉蚜DNA样品浓度在 155～300 ng/mL，D260 nm/D280 nm值在1.65～1.88之间。经琼脂糖电泳检测，点样泳道均检测出明亮清晰的DNA条带，说明改进的SDS法提取枸杞棉蚜的DNA质量较高、完整、无降解，点样孔有微量蛋白质、多糖等杂质（图1）。结果表明，提取的DNA能够满足SSR-PCR试验要求。

2.2单因素优化试验

以枸杞棉蚜为材料，进行单因素优化试验，5个因素对SSR-PCR试验影响见图2。

单因素优化试验结果表明，DNA浓度对扩增影响不大，在设定的DNA浓度下均能扩增出谱带，随DNA用量增加，扩增产物增多，其中40 ng扩增条带最清晰；DNA浓度高于 60 ng/μL，扩增产率高，但条带模糊。

Taq DNA 聚合酶直接影响PCR扩增效率，0.5 U反应不能扩增出目的条带，含量高于2.5 U反应时，反而抑制扩增，使扩增条带弥散。

设定的Mg2+浓度不同，扩增效果不同，150～250 μmol/L均能扩增出目的条带。Mg2+作为Taq酶的激活剂，浓度高于175 μmol/L时有非特异性扩增，Mg2+浓度升高时，会使PCR扩增产物背景加深。

dNTPs是PCR扩增中磷酸基团的来源，低浓度易使其过早消耗，扩增效果差，多为扩增单链；高浓度的dNTPs，导致Taq酶错误掺入，引起错配，产生非特异性扩增，浓度大于 300 μmol/L 时，过量的dNTPs会与聚合酶结合抑制PCR反应。

引物作为PCR扩增的原料，引物成功与模板DNA结合，便可扩增出有效片段，0.3～0.6 pmol/μL引物模板均能与DNA模板有效结合，都能扩增出条带，引物模板浓度高于 0.7 pmol/μL，引物易与自身结合并扩增，形成引物二聚体。

2.3正交优化试验

由图3可见，重复1中有5个组合没有扩出条带，另有2个组合条带很弱；重复2中有1个组合没有扩增条带，说明正交试验所设计的各个试验因素浓度梯度均没有偏离最适范围。依照评分标准，对各处理进行等级评分，依据条带强弱及杂带多少，2次处理评分结果分别为7、6，6、6，4、4，6、2，6、8，6、6，7、5，5、3，2、2，6、6，8、6，1、3，1、3，2、4，6、6，6、7，1、1，6、3，1、6，4、6，5、6，1、4，6、5，5、6，1、1。其中处理14重复性好，分值均较高，对比单因素试验结果，选择处理14作为最佳反应体系（50 ng模板DNA，1.5 U Taq DNA聚合酶，150 μmoL/L Mg2+，300 μmol/L dNTPs，0.4 pmoL/μL引物）。

本研究首先根据电泳平均得分求出每个因素下各水平的和Ti，然后求出每个因素下各水平的均值ki；最后求出同一因素ki的极差R。R越大，影响越大。极差分析结果（表3）表明，各因素影响大小排序为dNTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。因极差分析不能估计试验误差，无法确定分析的精度，为了判断各因素对棉蚜SSR-PCR反应的影响是否显著，笔者利用 SPSS 17.0对结果进一步进行方差分析，与极差分析结果一致，由Ⅲ型平方和比较可知，对扩增的影响排序为dNTPs>Mg2+>引物> Taq DNA聚合酶=DNA。dNTPs、Mg2+、引物对棉蚜SSR-PCR反应的影响极显著，Taq DNA聚合酶、DNA对棉蚜SSR-PCR反应的影响显著（表4）。

2.4PCR反应退火温度的筛选

退火温度决定PCR的特异性，引物退火温度在理论退火温度基础上进行设置，共设置5个温度梯度，依次为58、61、64、67、70 ℃。图4结果表明，PCR试验不同退火温度的条带特异性和敏感度均比较好，泳道的背景颜色随着退火温度升高而加深，其中58 ℃的条带特异性最优。

2.5最佳反应体系的验证

利用获得的最佳体系，用引物Ago53、Ago89对反应体系的验证结果（图5）表明，2对引物条带清晰，重复性好。

3结论和讨论

利用单因素试验结果分别分析5个因素对PCR反应的影响趋势，并利用正交优化试验研究5个因素对PCR反应的综合影响。综合单因素试验和正交设计试验结果，同时考虑到试剂成本，最终获得枸杞棉蚜SSR-PCR最优组合：枸杞棉蚜SSR-PCR的优化体系总体积为25 μL，包括50 ng模板DNA、 1.5 U Taq DNA聚合酶、150 μmoL/L Mg2+、300 μmol/L dNTPs、0.4 pmoL/μL引物PCR；适宜扩增程序为94 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 30 s、35次循环，72 ℃ 5 min。

单因素试验表明，模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物浓度5个因素均具有促进或抑制SSR-PCR扩增的影响。同刘永刚等利用单因素研究的桃蚜SSR最優反应体系[16]相比，枸杞棉蚜SSR研究所用Taq酶及DNA的量较少，说明Taq DNA聚合酶及DNA对SSR-PCR影响较小，少量即可满足枸杞棉蚜SSR-PCR，优化后的体系更为经济。正交试验表明，5个因素的影响大小排序为dNTPs>Mg2+>引物>Taq DNA 聚合酶=DNA。这一结果同谢家楠等研究的白背飞虱简单重复序列区间（ISSR）反应体系结果[17]基本一致，同张敏哲等研究的宽翅曲背蝗SSR反应体系结果相比，影响因素大小排序完全相反[18]，这可能是由于材料物种的差异造成的。

dNTPs是影响枸杞棉蚜SSR-PCR的最主要因素，为扩增时的4种核苷酸原料，低浓度使其过早消耗，扩增效率低。高浓度的dNTPs导致Taq酶错误掺入，引起错配，产生非特异性扩增，而浓度过高则会与 Taq DNA聚合酶竞争性结合Mg2+，使酶反应活性降低，从而降低扩增效率。单因素扩增表明，dNTPs浓度为300 μmol/L时，过量的dNTPs会与聚合酶结合而抑制PCR反应；但是，由于存在5个因子的互作作用，在正交试验中，优化的体系中dNTPs浓度为300 μmol/L。Mg2+是影响枸杞棉蚜SSR-PCR的主要因素，它作为Taq DNA 聚合酶的催化剂，当浓度高于175 μmol/L时，能抑制Taq DNA 聚合酶的活性，有非特异性扩增，Mg2+离子浓度升高时，会使PCR扩增产物背景加深。本研究单因素试验与正交试验结果表明，150 μmol/L Mg2+是最适浓度。引物对 SSR-PCR影响也较大，单因素试验表明，作为结合模板DNA的原料的引物，引物浓度过高易产生引物二聚体或抑制扩增，并且正交试验结果也表明，适合的引物浓度为0.4 pmoL/μL。本研究中Taq DNA 聚合酶、模板DNA、引物的退火温度对SSR-PCR的影响较小，少量的Taq DNA 聚合酶、模板DNA和低的退火温度即可获得明亮清晰的特异性条带。

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