用气质联谱法测定中华蜜蜂体内保幼激素

李新宇 文 平 程亚楠 董 坤 谭 垦

（云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明650201）

用气质联谱法测定中华蜜蜂体内保幼激素

李新宇 文 平 程亚楠 董 坤 谭 垦

（云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明650201）

保幼激素是由蜜蜂咽侧体分泌出的一类高萜类化合物，在蜜蜂生长发育、变态以及生殖发育过程中扮演着重要的角色。本实验用气质联谱法检测了中华蜜蜂1，3，5日龄幼蜂的保幼激素含量。结果表明：在各龄中华蜜蜂体内都能检测到JH3，且蜜蜂随日龄增长，体内保幼激素含量增加。

中华蜜蜂；保幼激素；气质联谱法

1 引言

保幼激素 (juvenile hormone,JH)是由昆虫咽侧体分泌出的一类高萜类化合物，是节肢动物的重要内激素，先前大量的研究表明，JH在昆虫的生长发育、变态以及生殖器官发育过程中扮演着重要的角色[1]。

目前从昆虫中已分离出3种具有JH活性的化合物，分别称为JH1、JH2、JH3，它们的生理活性大不相同。其中JH3是大部分成虫的主要激素，也是蜜蜂体内的保幼激素成分[2]。保幼激素调节蜜蜂的变态、繁殖和行为发育，由幼虫和成蜂食道两侧的两个球形器官咽侧体合成。咽侧体和其他两个内分泌器官由神经相连，脑部通过神经内分泌信号调节咽侧体的活性。保幼激素和蜕皮激素一起控制幼虫和蛹的成长和发育[3]。蜜蜂发育经历6次蜕皮，5次发生在幼虫阶段，最后一次发生在蜜蜂羽化为成蜂的时候。幼虫蜕皮后成为更大的幼虫或发育到蛹依赖于蜕皮激素和保幼激素的平衡。保幼激素水平的变化诱导幼虫到蛹、蛹到成蜂的蜕皮发生。同时保幼激素对蜜蜂有促进雌性生殖系统发育和调节卵黄原蛋白合成的作用[4]。保幼激素能刺激蜂王脂肪体合成卵黄原蛋白，从而促进生殖系统发育[5]。

JH在结构上属于倍半萜环氧甲基酯，是小分子亲脂生理活性物质，在生物体内以微量形式存在，处于不断合成和降解的动态过程中[6]。JH在成蜂体内含量甚微，且不易与脂类物质分离，使得在生理水平上测定JH的滴度很困难。自1934年Wigglesworth发现JH以后很长时间，JH主要通过结扎、器官切除和移植、生物测定等加以判断。由于生物分析法测定的灵敏度和特异性都远远不能满足要求，到20世纪70年代以后逐步发展了JH的色谱分析法(如GC/MS法)和放射免疫分析法(RIA法)[7]。但这些早期的方法操作较复杂，仪器设备要求也较高，有的还需制备衍生物，故测定有一定难度。随着现代色谱技术的发展，以及毛细管柱的出现使得检测下限已达到＜1 ng的水平[8]。因此理论上已完全达到测定小型昆虫体内JH含量的水平，使用气质联谱法测定中华蜜蜂体内JH含量变得较为简易可行。

2 材料与方法

2.1 实验材料

中华蜜蜂样本采自云南农业大学东方蜜蜂研究所蜂场内蜂群。从中选取一强群，提取子脾。待蜜蜂出房后收集到饲养盒中饲养。待到一定日龄（1，3，5日龄）时用采集瓶采集蜜蜂待用。

2.2 实验试剂

JH3标准样品为美国Sigma公司的产品。正己烷和甲醇，乙酸乙酯为国产分析纯试剂。

2.3 实验仪器

美国Agilent公司7890B型气相色谱仪，氢火焰离子化检测器。德国Eppendorf 22331型高速冷冻离心机，涡旋震荡仪，离心浓缩系统,电子天平及其他仪器。

2.4 样品提取

取供试蜜蜂，用正己烷清洗虫体表面杂质，滤纸吸干水分，电子天平称重后移入研钵中,加液氮研磨直至粉末状。取出粉末加1.5 ml缓冲溶液，充分震荡摇匀，再加入1 ml正己烷充分震荡摇匀。在15000 rpm，4℃条件下离心10 min，取上清液。

2.5 分离纯化

分离纯化使用填充硅胶的毛细管层析柱。纯化前使用离心浓缩系统进行浓缩,正己烷定容至 20 μl进样。用洗脱液冲洗层析柱，并接收冲洗出来的洗脱液。

2.6 色谱条件

0.32 mm×30 m HP-5色谱柱，150℃开始升温，然后4°C/min到200°C，20°C/min到280°C，到280℃止，进样口温度280℃，检测器温度280℃。进样量2 μl。

3 结果与分析

3.1 全过程回收率试验

取一定量JH标准样品于提取液进行全过程提取处理，测得JH3回收率为96.7%。标样上机检测结果表明，两种标样分离效果甚佳，出峰时间重现性好，回收率高，表明本试验所采取的方法可用于JH滴度测定。

3.2 中华蜜蜂体内保幼激素含量测定

测定结果表明，中华蜜蜂像大多数昆虫一样，体内含有保幼激素Ⅲ。中华蜜蜂1,3,5日龄幼蜂体内JH3变化从1～5龄呈上升趋势（表1）。经质谱检测器的检测结果表明，标准样本的质谱图与中华蜜蜂样本的质谱图一致，表明所测样本中含有JH3这种保幼激素。

表1 不同日龄成年工蜂的保幼激素含量(单位:ng)

4 讨论与结论

保幼激素在蜜蜂的生长发育、变态以及生殖发育过程中起至关重要的作用。研究结果表明，不同日龄中华蜜蜂均含有一定量的JH3，说明中华蜜蜂像大多数昆虫种类一样，保幼激素在其发育变态过程中起重要的调节作用。检测发现，同日龄的中华蜜蜂中保幼激素的含量变化有一定差异，这种变化有可能是导致蜜蜂不同日龄负责不同工作的原因，因此进一步开展对JH含量在蜜蜂体内的动态变化及JH含量在蜜蜂级型分化和其他生理生化过程中的作用的研究是很有必要的。

图1 保幼激素标样和蜜蜂样本的色谱图

GC-MS是目前公认的JH鉴定方法，测定精度和可信度高，是JH未知种类鉴定的唯一客观方法[9，10]。

[1]Riddiford L M.Cellular and molecular actions of juvenile hormonesⅠ.General considerations and premetamorphic actions[J]. Advances in Insect Physiology,1994,24:213-274.

[2]李乾君，龚和，管致和.昆虫卵黄发生研究进展[J].昆虫学报，1995,38(2):237-251.

[3]董言德，薛瑞德，赵彤言，等.保幼激素III对三带喙库蚊滞育发生期间卵巢滤泡和体内RNA变化的影响 [J].中国媒介生物学及控制杂志，1998,9(3):161-164.

[4]周冰峰，鲍秀良，龚蜜，等.保幼激素类似物ZR-512对蜜蜂蜂王初生重的影响[J].福建农业大学学报，1995,24(1):109-112.

[5]周冰峰，龚蜜，鲍秀良，等.保幼激素类似物ZR-512对蜜蜂蜂王胚后发育的调控作用[J].福建农业大学学报，1995,24(2):227-230.

[6]Tobe S S,Feyereisen R.Juvenile hormone biosynthesis:regulation and assay[A].//Downer R G H,Laufer H.Endocrinology of insects[M].New York:Alan R Liss,1983:161-178.

[7]杨亦桦，戴华国，韩航如，等.用HPIC测定稻褐飞虱体内的保幼激素[J].华东昆虫学报，1997,6(2):24-27.

[8]Edwards J P,Corbitt T S,Mcardle H F,et al.Endogenous levels of insect juvenile hormones in larval,pupal and adult stages of the tomato moth,Lacanobia oleracea[J].J.Insect Physiol.,1995,41(8): 641-651.

[9]Park Y I,Shu Shengqiang,Ramaswamy S B,et al.Mating in Heliothis virescens:transfer of juvenile hormone during copulation by male to female and stimulation of biosynthesis of endogenous juvenile hormones [J].Arch.Insect Biochem.Physiol.,1998,38(2): 100-107.

[10]Yin Chihming,Zou Baixiang,Jiang Mugeng,et al.Identification of juvenile hormone III bisepoxide(JHB3),juvenile hormone III and methyl farnesoate secreted by the corpus allatum of Phormia regina (Meigen),in vitro and function of JHB3either applied alone or as a part of a juvenoid blend [J].J.Insect Physiol.,1995,41(6): 473-479.

Determination of juvenile hormone in Apis cerana cerana by GC/MS

Li Xinyu,Wen Ping,Cheng Yanan,Dong Kun,Tan Ken

(Eastern Bee Research Institute of Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

Juvenile hormone is secreted by the bees corpus allatum of the terpenoids.Juvenile hormone on the growth and development of bees,abnormal reproductive development and plays an important role in the process.This experiment determination of juvenile hormone in Apis cerana cerana by GC/MS in 1,3,5 day age.Results show that the bees in the body can be detected JH3 in every age,and the bees along with the age growth,the juvenile hormone content in the body.

Apis cerana cerana;juvenile hormone，GC/MS

国家现代蜂产业技术体系项目（CARS-45-kxj14）

李新宇（1989-），男，在读硕士，主要从事蜜蜂生物学研究

谭垦，男，教授，博导，主要从事蜜蜂生物学研究，E-mail:eastbee@sina.com