基于“伴随标志物”在线控制技术的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分鉴定研究

范冬冬 匡艳辉　董利华　叶潇　陈两绵　张东　马振山　王锦玉　朱晶晶　王智民　王德勤　李楚源

[摘要] 基于“伴随标志物”紫外在线检测技术以绞股蓝总皂苷（GPS）为目标，优化绞股蓝中GPS的纯化工艺，采用UPLCQTOFMS技术对GPS进行定性。“伴随标志物”紫外在线检测研究表明，上样终点为流出液吸光度为原药液的1/2时，洗脱终点为洗脱流出液吸光度基本稳定。UPLCQTOFMS鉴定出GPS提取物中的16个皂苷，其中新皂苷3个。该研究优选出的纯化工艺简单、检测方便、易于在线测定、实时记录，能较好的运用到大生产或生产的自动化中。质谱定性鉴定结果表明，基于“伴随标志物”紫外在线检测技术能很好地保留药材中的主要药效成分，为过程控制和质量溯源提供了分析工具。

[关键词] 绞股蓝总皂苷； 纯化； 大孔吸附树脂； 伴随标志物； 在线检测； UPLCQTOFMS

Purifying process of gynostemma pentaphyllum saponins based on

"adjoint marker" online control technology and identification of

their compositions by UPLCQTOFMS

FAN Dongdong1，2， KUANG Yanhui3， DONG Lihua 2， YE Xiao 1，2， CHEN Liangmian2， ZHANG Dong 2，

MA Zhenshan2， WANG Jinyu2， ZHU Jingjing2*， WANG Zhimin2*， WANG Deqin3， LI Chuyuan3

（1. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China；

2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Institute of

Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China）

[Abstract] To optimize the purification process of gynostemma pentaphyllum saponins （GPS） based on "adjoint marker" online control technology with GPS as the testing index. UPLCQTOFMS technology was used for qualitative analysis. "Adjoint marker" online control results showed that the end point of load sample was that the UV absorbance of effluent liquid was equal to half of that of load sample solution， and the absorbance was basically stable when the end point was stable. In UPLCQTOFMS qualitative analysis， 16 saponins were identified from GPS， including 13 known gynostemma saponins and 3 new saponins. This optimized method was proved to be simple， scientific， reasonable， easy for online determination， realtime record， and can be better applied to the mass production and automation of production. The results of qualitative analysis indicated that the "adjoint marker" online control technology can well retain main efficacy components of medicinal materials， and provide analysis tools for the process control and quality traceability.

[Key words] gynostemma pentaphyllum saponins （GPS）； purification； macroporous absorptive resin； adjoint marker； online detecting； UPLCQTOFMS

絞股蓝Gynostemma pentaphyllum （Thumb.） Makino为葫芦科多年生草质藤本植物，有“南方人参”和“第二人参”的美誉，别名小苦药、公罗锅底、五叶藤、遍地生根，在日本民间称“甘茶蔓”[12]。早在我国明代《救荒本草》中已有记载，绞股蓝性寒味甘，具有清热解毒、补气生津、祛痰止咳、安神固精之功。绞股蓝中主要活性成分为达玛烷型皂苷类成分，且含量较高；它具有保护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、调血脂、保肝、抗氧化、抗溃疡以及抗衰老等多种活性[3]。

绞股蓝药材品种来源较为混乱，不同产地同一品种、不同种植品种、不同药用部位等，其皂苷含量及成分都存在很大差异，也许是迄今药典尚未法定标准的难点所在。据悉绞股蓝皂苷（GPS）提取物原料生产商使用的是根，而部颁标准WS3Z00693（Z）指定使用部位為全草；全草和根的成分存在很大差异，加上缺乏对照品，致使很多企业难以复制出其生产工艺。

纯化皂苷的工业化常规手段是大孔吸附树脂法，实际生产中往往主要依赖经验的终点放行模式，或辅助旁线或离线手段（TLC法和分光光度法测定皂苷），加上对GPS的含量要求较高（要求“总皂苷≥80%”），实际生产中往往难以实现不间断生产，甚至不得不反复纯化，这样又可能导致其次生皂苷成分的生成而致成分更复杂，生产的重复性和质量的均一性很难保证，同时也难以实现生产的自动化和连续化。为解决该问题，以洗脱液的旁线检测（TLC检测成分、UVVIS测定皂苷和含固量的测定）为指标为指示，设计并建立洗脱液中“伴随标志物”（有UV吸收者）与皂苷（无UV吸收）间的关系，并以伴随标志物的吸光度作为快速判断过程监测和终点放行的指标，实现对皂苷类成分在纯化过程的“替代”在线控制和实时监测。

本研究以绞股蓝皂苷为对象，基于“伴随标志物”的紫外在线检测，实现对无紫外吸收皂苷的过程控制，为工业化连续生产提供了一种简单易行、准确可靠的检测技术；同时对纯化得到的GPS进行主成分定性分析，以保障原料与成品间质量的可溯源性。

1 材料

梅特勒精密电子天平（XS105DU）；紫外可见分光光度计（T6新世纪）；N1100型EYELA旋转蒸发仪（上海安亭科学仪器制造）；SB1100 EYELA水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）；TGL16G台式离心机（上海安亭科学仪器制造）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Xevo G2S QTOF质谱仪（美国Waters公司）；配有Lockspray 接口，电喷雾离子源（ESI），MassLynx4.1质谱工作站；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱（Waters公司）。

绞股蓝皂苷XLIX对照品（纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇、乙醇、冰乙酸、高氯酸（分析纯）、石油醚（分析纯）、Fisher 乙腈、甲酸（质谱纯）、5%香草醛冰乙酸溶液；HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500，NKAⅡ大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工）；SP825L（北京绿百草）；绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的干燥地上部分，实验用样品为福建漳州绞股蓝的叶子，品种鉴定经叶华谷研究员鉴定为绞股蓝G. pentaphyllum。

2 方法与结果

2.1 绞股蓝总皂苷的测定

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取绞股蓝皂苷XLIX对照品10.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为2.00 g·L-1的溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取绞股蓝总皂苷10.00 mg，置2 mL离心管中，加石油醚2 mL，超声处理10 min，6 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取部分6 000 r·min-1离心10 min，得供试品。

2.1.3 标准曲线的绘制

精密吸取绞股蓝皂苷XLIX对照品溶液（2.00 g·L-1）10，20，40，60，80，100 μL分别置15 mL具塞试管中，挥干，精密加入新配制的5%香草醛冰乙酸溶液与高氯酸（2∶8）的混合液2 mL，摇匀，密塞，置60 ℃水浴中加热15 min，立即放入冷水中冷却至室温，分别精密加冰乙酸10 mL，摇匀，以试剂作空白，按照紫外可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录VA）试验，在550 nm的波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、以质量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程Y=1.088 4X-0.003 3，r=0.999。结果表明，取样量在0.01～0.20 mg 有良好的线性关系。

2.1.4 绞股蓝总皂苷含量测定方法

精密量取供试品200 μL置15 mL具塞试管中，挥干甲醇后按2.1.3项下操作，测定吸光度，用标准曲线计算出绞股蓝总皂苷的质量。

2.2 大孔吸附树脂型号筛选

2.2.1 大孔吸附树脂静态吸附和解吸实验考察

2.2.1.1 大孔吸附树脂预处理 7种不同型号大孔吸附树脂（HPD100HPD500，SP825L，NKAⅡ）分别用95%乙醇浸泡24 h，充分溶胀，用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色浑浊现象时为止，最后用去离子水洗至无醇味，备用。

2.2.1.2 静态吸附和解吸 30%乙醇回流提取2次，料液比为1∶8，每次提取1.5 h，合并提取液，减压浓缩至生药含量0.1 g·mL-1即为提取液。称取各型号经预处理的树脂5 g（湿质量）置于100 mL锥形瓶中，各加入绞股蓝提取液50 mL，持续振摇30 min，静置12 h后，抽滤，得吸附后的滤液。将吸附后的各型号树脂滤出后分别另置100 mL锥形瓶中，各加入95%乙醇50 mL，其余操作同上，得解吸后的滤液。精密量取吸附后的滤液100 μL、原料液30 μL和解吸后的滤液50 μL置15 mL具塞试管中，挥干后按2.1.3项下操作，测定吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量。单位树脂饱和吸附量=（原料液总皂苷质量-吸附后滤液总皂苷质量）/湿树脂的量；解吸率=解吸后的滤液总皂苷质量/饱和吸附量×100%。根据以上公式计算每种树脂对总皂苷的静态饱和吸附量及解吸率（原料液总皂苷质量为244.78 mg），结果见表1。

由表1可见，HPD系列树脂的饱和吸附量及解吸率都优于其他2种类型树脂（SP825L，NKAⅡ），综合吸附及解吸2方面因素考虑，可以认为HPD系列树脂对绞股蓝总皂苷具有较好的吸附及解吸能力，因此选用HPD系列树脂来进行下一步考察。

2.2.2 HPD系列树脂对绞股蓝总皂苷的吸附

取绞股蓝提取液6份，每份120 mL，1份蒸干得绞股蓝提取物，称重；另外5份分别通过预先处理好的HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500型大孔吸附树脂柱，静置过夜，再分别以2倍柱体积去离子水和3倍柱体积95%乙醇洗脱，95%乙醇洗脱液浓缩，干燥、收粉，得绞股蓝总皂苷，称重。同2.1.2的操作，在同一条件下测量吸光度，由标准曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量，见表2。

从表2可以看出，HPD系列大孔吸附树脂对绞股蓝提取液有很好的吸附和纯化效果。综合考虑几种树脂的吸附和解吸附能力，最终选用HPD500大孔吸附树脂进行绞股蓝总皂苷的纯化。

2.3 HPD500树脂对总皂苷纯化工艺的考察

2.3.1 “伴随标志物”紫外吸收与总皂苷的关系

取生药量为 0.1 g·mL-1的提取液以3倍柱体积每小时的流速上样，通过树脂柱进行吸附，吸附饱和后，静置12 h，然后分别用10倍柱体积去离子水洗脱，再分别用10倍柱体积10%乙醇、7倍柱体积15%乙醇、8倍柱体积20%乙醇和10倍柱体积70%乙醇洗脱，每个柱体积为1个流分，收集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接进行紫外检测，然后计算每一个流分的总皂苷含量，建立每个流分的紫外吸收值与总皂苷含量之间的相关性，结果见图1。

由上图及数据可得，“伴随标志物”紫外吸收与总皂苷含量有正相關性，所以可以通过检测“伴随标志物”的紫外吸收来监测绞股蓝总皂苷的含量变化。

2.3.2 上样量的考察

2.3.2.1 最大吸收波长的确定 对浓缩处理好的原料液在600～800 nm波长下扫描。样品在665 nm处有最大吸收，所以选择检测波长为665 nm。

2.3.2.2 上样量在线检测 常规方法通常采用每次测定流出液中皂苷含量来判断泄露率，此操作繁琐且出结果时间较长。因此考虑把泄露率与流出液的“绞股蓝皂苷伴随物”（简称伴随物）紫外吸收关联起来，从而通过测定出口洗脱液的“伴随物”紫外吸收来判断上样终点，此方法简单、方便、可行。

用处理好的HPD500树脂装柱，取生药量为 0.1 g·mL-1的提取液测定样品上样液的紫外吸光度，以3倍柱体积每小时的流速不断上样，以1倍柱体积为1个流分，取其一半蒸干，计算各自的含固量及总皂苷含量，并计算泄露率，取另一半流分直接进行紫外检测，建立各流分的总皂苷泄露率与“伴随物”紫外吸收间的相关性，确定最大上样量，结果见图2，实现通过紫外吸收值来判断上样终点的目的。

图中连续考察了1～32倍柱体积的上样量，分别统计了各流分中绞股蓝总苷泄露率和相应的紫外吸光度。当上样量为21倍柱体积时，流出液中绞股蓝皂苷泄露率92.90%；流出液的吸光度0.172，原料液吸光度0.328；当上样量为22倍柱体积时，洗脱液的绞股蓝皂苷泄露率为102.34%，对应的吸光度为0.178，因此当绞股蓝皂苷达100%泄露时，洗脱液的“伴随物”紫外吸光度接近于原料液紫外吸光度的1/2。由此建议，当出口洗脱液与上样原料液紫外吸光度比值为1∶2时，即确定为上样终点。

2.3.3 洗脱梯度考察

2.3.3.1 梯度洗脱 提取液以3倍柱体积每小时的流速上样，通过树脂柱进行吸附，吸附饱和后，静置12 h，然后分别用8倍柱体积去离子水洗脱，再分别用8倍柱体积15%乙醇和8倍柱体积70%乙醇洗脱，每个柱体积为1个流分，收集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接进行紫外检测，然后计算每个流分的含固量及总皂苷含量，建立每个流分的紫外吸收值与含固量及总皂苷含量之间的相关性，通过紫外吸收度来判断每个梯度洗脱终点。

2.3.3.2 最大吸收波长的确定 分别选取各梯度洗脱液1份在500～800 nm波长下扫描。本着吸光度小于1，且各梯度均有良好的吸收，故选择在555 nm作为检测波长。

2.3.3.3 洗脱梯度在线检测 建立每个流分的“伴随物”紫外吸收、含固量及总皂苷含量关系图，结果见图3。

由图可得，当洗脱流出液吸光度基本稳定时可换下一个梯度进行洗脱，用70%乙醇洗脱时，吸光度基本稳定时就是洗脱终点。

2.4 纯化工艺验证

用处理好的HPD500树脂20 mL装柱，取生药含量为0.1 g·mL-1的提取液上样，通过紫外检测下口流出液紫外吸收为上样液的1/2时即为上样饱和，静态吸附12 h后进行洗脱，树脂柱先分别用去离子水和15%乙醇洗脱除杂，除杂终点为下口流出液吸光度基本稳定，然后用70%乙醇洗脱，洗脱终点同样是流出液吸光度基本稳定且吸光度很小，收集70%乙醇洗脱馏分减压浓缩，浓缩液减压蒸干，得绞股蓝总皂苷。同2.1.2的操作，在同一条件下测量吸光度，由标准曲线方程求得总皂苷的纯度为84.24%，皂苷转移率65.50%，可见经优选的工艺是可行的。

2.5 总皂苷UPLCQTOFMS定性分析

2.5.1 供试液的制备

称取绞股蓝总皂苷3.73 mg，2 mL甲醇溶解，离心（12 000 r·min-1，10min），取上清液，即得。

2.5.2 UPLCMS条件

2.5.2.1 UPLC条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相乙腈（A） 0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～3 min，30%～35%A；3～8 min，35%～45%A；8～12 min，45%～60%A；12～15 min，60%～80%A）；流速0.4 mL·min-1；进样体积1 μL；柱温35 ℃；自动进样器温度20 ℃；PDA检测器扫描范围200～400 nm。

2.5.2.2 质谱条件 ESI离子源，正负离子模式扫描，毛细管电压为2 kV，锥孔电压为40 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂气体流量600 L·h-1，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气体流量50 L·h-1，母离子碰撞能量6 eV，碎片离子碰撞能量20～50 eV，扫描范围m/z 100～2 000，扫描时间0.2 s。

2.5.3 绞股蓝总皂苷UPLCQTOFMS定性分析

通过对照品比对、UPLCMS碎片信息以及结合文献数据，从绞股蓝总皂苷中共指认16个化合物，其中包括13个已知和3个新皂苷，结果见表3。其总离子流图见图4。

指认的16个化合物中，其中化合物3即Gyp ⅩLⅥ是通过对照品比对得出，其余都是结合碎片信息及查阅相关文献得出。已知的13個皂苷中，其母核结构见图5，其中主要是类型I的化合物。绞股蓝皂苷不仅有不同的母核结构，而且还连有不同的糖链，所以绞股蓝皂苷中存在着大量的同分异构体。通过UPLCQTOFMS定性分析时，同一个分子离子峰会对应着不同的化合物。根据裂分规律及碎片离子信息，推测化合物6中含有3个葡萄糖、1个五碳糖和1个乙酰基，化合物10中含有3个葡萄糖和1个乙酰基，化合物14中含有2个葡萄糖和1个乙酰基，这3种化合物未见文献报道，是3个新的绞股蓝皂苷。

3 讨论

大孔树脂吸附分离纯化中药是一个比较复杂的过程，对成分有吸附和分子筛等不同机制。对于纯化特定类别的成分达到“尽可能少地损失拟要成分，尽可能多地去除杂质”才是最理想的状态，要实现该目的，对生产过程的实时在线监测就显得尤为重要。对于黄酮类成分，由于其自身有紫外吸收，在纯化总黄酮的过程中可以较容易利用紫外检测器实现对产品生产全过程进行在线检测和过程控制，特别是终点放行及其标准的制定；而该方法显然不适用于皂苷类成分（无紫外吸收），无法直接进行实时监测和在线控制；要实现对皂苷的过程控制，一般都是要对洗脱液进行取样、浓缩、化学反应、可见光检测等，才能了解洗脱液的皂苷含量情况，进而判定终点，这样显然时间长、操作繁琐、准确度差，无法满足产业化规模生产的需求。因此，开发适于无紫外吸收的皂苷类物质的在线快速检测方法和技术对产业化的发展具有重要的意义。本实验对“伴随标志物”的紫外吸收与皂苷含量进行相关性分析，通过检测洗脱液的紫外吸收来判定上样终点以及洗脱过程起点与终点，进而实现实时监测和在线控制，该技术可应用于工业化生产，具有良好的开发前景。

绞股蓝品种繁多，不同产地绞股蓝皂苷主成分差异很大，共有成分稀少甚至没有，这对绞股蓝药材及提取物的质量控制是一个挑战。现采用UPLCQTOFMS技术可以快速、明确的指认出绞股蓝总皂苷提取物中主要的绞股蓝皂苷，这可为绞股蓝提取物质量控制提供一种技术手段，同时还为明确其药效物质基础提供了理论依据。

[参考文献]

[1] 何显忠， 邱江沁. 绞股蓝化学成分和药理作用研究进展[J]. 中国中医药信息杂志， 2008， 15 （增刊）： 84.

[2] 张涛， 袁弟顺. 绞股蓝的功效成分及绞股蓝皂甙研究进展[J]. 江西农业学报， 2008， 20（9）： 60.

[3] 史琳. 绞股蓝的化学成分研究[D]. 沈阳： 沈阳药科大学， 2010.

[4] Takemoto T， Arihara S， Nakajima T， et al. Studies on the constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. Ⅰ. Structures of gypenoide ⅠⅩⅣ [J]. Yakugaku Zassh， 1983， 103（2）： 173.

[5] Yoshikawa K， Takemoto T， Arihara S..Studies on the constituents of Cucurbitaceae plants. ⅩⅤ. On the saponin constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. （10） [J]. Yakugaku Zassh， 1986， 106（9）： 758.

[6] Tsai Y C，Lin C L，Chen B H. Preparative chromatography of flavonoids and saponins in Gynostemma pentaphyllum and their antiproliferation effect on hepatoma cell [J]. Phytomedicine， 2010， 18：2.

[7] Hung T M， Thu C V， Cuong T D， et al. Dammaranetype glycosides from Gynostemma pentaphyllum and their effects on IL4induced eotaxin expression in human bronchial epithelial cells [J]. J Nat Prod， 2010， 73（2）： 192.

[8] Yoshikawa K， Arimitsu M， Kishi K， et al. Studies on the constituents of Cucurbitaceae plants. ⅩⅧ. On the saponin constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino.（13） [J]. Yakugaku Zassh， 1987， 107（5）： 361.

[9] Takemoyo T，Arihara S，Nakajima T，et al. Studies on the constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. Ⅱ. Structures of gypenoide ⅩⅤⅩⅪ [J]. Yakugaku Zassh， 1983， 103（10）： 1015.

[10] Yoshikawa K，Mitake M，Takemoto T，et al. Studies on the constituents of Cucurbitaceae plants. ⅩⅦ. On the saponin constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. （12） [J]. Yakugaku Zassh， 1987， 107（5）： 355.

[11] Liu X， Ye W C， Mo Z Y， et al. Five new ocotillonetype saponins from Gynostemma pentaphyllum [J]. J Nat Prod， 2004， 67（7）： 1147.

[12] Hu L H， Chen Z L， Xie Y Y. Dammaianetype glycosides from Gynostemma pentaphylium [J]. Phylochemistiy， 1997， 44（4）： 667.

[13] Xing S F， Jang M， Wang Y R， et al.A new dammaranetype saponin from Gynostemma pentaphyllum induces apoptosis in A549 human lung carcinoma cells [J]. Bioorg Med Chem Lett， 2016， 26： 1754.

[14] Takemoto T， Arihara S， Yoshikawa K，et al.Studies on the constituents of Cucurbitaceae plants. Ⅶ. On the saponin constituents of Gynostemma pentaphyllum Makino. （3） [J]. Yakugaku Zassh， 1984， 104（4）： 325.

[责任编辑 孔晶晶]