三种不同腺病毒基因组提取方法对全基因组克隆构建的影响分析

李潇　周荣　马强

[摘要] 目的 建立一种简单、快速、有效、纯度高的人腺病毒全基因组提取的方法。 方法 用60 mm细胞培养皿培养A549或AD293细胞，接种培养人7型腺病毒（HAdV-7）CQ1198株，收集病毒感染的細胞，分别用Hirt's改良法、试剂盒A和试剂B提取HAdV-7-CQ1198病毒株全基因组，提取的基因组进行限制性内切酶酶切实验、细菌内同源重组实验和转染细胞拯救病毒实验。 结果 几种方法都成功获得高质量的腺病毒全基因组，可以用于PCR、测序、酶切、同源重组和转染实验；两种试剂盒方法较传统的Hirt's改良法更快，不需要特别步骤去除细胞基因组，可以在1 h内完成基因组提取。其中，试剂盒A提取的病毒基因组量最多（20～50 μg），RNA含量最少，不需要另外加入核糖核酸酶（RNase），而Hirt's改良法需要在裂解液中或最终产物中加入RNase以去除细胞RNA成分。 结论 试剂盒A和试剂盒B均可替代传统Hirt's提取方法用于快速提取高质量腺病毒基因组，提取的基因组能用于酶切分型、转染等实验操作。

[关键词] 腺病毒；病毒核酸提取；酶切分析；病毒感染；Hirt's方法

[中图分类号] R373 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0004-04

[Abstract] Objective To construct a simple， fast， efficient， high purity method for adenovirus genome extraction. Methods A549 or AD293 cells were cultured in 60 mm culture dish， and infected with human adenovirus type 7 （HAdv-7） CQ1198 strain. The infected cells were collected to extract adenovirus genome by using improved Hirt's method， Extraction Kit A and Extraction Kit B. The extracted adenovirus genomes were detected by restriction endonuclease analysis， homologous recombination method， transfection and virus rescue experiment. Results High-quality adenovirus genomes were obtained by three different methods. The extracted DNA can be used for PCR， sequencing， restriction endonuclease analysis， homologous recombination and transfection experiment. The extraction process used two kinds of Kits were faster than improved Hirt's method， and all the Kit methods had no additional process to remove host cell's genome， the process can be finished in 1 hour. Compared all three kinds of methods， comprehensively， Extraction Kit A method obtained as most viral DNA as other methods （20-50 μg）， and it did not need RNase because the extracted product barely had RNA. Compare to the Kits， the improved Hirt's method needed RNase to remove cellular RNA in the lysate or in the final production. Conclusion Compare to the traditional Hirt's method， Extraction Kit A and Extraction Kit B can be used to extract high quality adenovirus genome， and the extracted product can also be used for enzyme-cutting type， transfection and other experimental operations.

[Key words] Adenovirus； Viral nucleic acid extraction； Restriction endonuclease analysis； Virus infection； Hirt's method

由于目前国内外并没有专门为腺病毒基因组提取设计的试剂盒，因此本研究首次尝试应用为PCR实验设计的普通病毒核酸提取试剂盒提取腺病毒全基因组，并与传统的Hirt's改良法进行比较，以期建立一种简单、快速且纯度高的人腺病毒全基因组提取方，具体报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料

人7型腺病毒（HAdV-7）CQ1198毒株（Genebank号：JX625134.1）由重庆医科大学附属儿童医院分离培养并惠赠。用60 mm细胞培养皿培养A549或AD293细胞，接种培养HAdV-7CQ1198毒株，感染2～3 d后吹打细胞收集到15 mL离心管，离心半径6 cm，800 r/min离心5 min去除上清，收集病毒感染的细胞转移至1.5 mL Ep管中。

1.2 方法

分别用改进的Hirt's方法、试剂盒A（High Pure Viral Nucleic Acid Kit，Roche，批号：10227300）和试剂B（Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，Takara，批号：AK2101Y）提取HAdV-7CQ1198病毒株全基因组，提取的基因组进行限制性内切酶酶切实验、细菌内同源重组实验和转染细胞拯救病毒实验。

1.2.1 改良Hirt's法提取腺病毒基因组 按文献报道的Hirt's改良法提取HAdV-7CQ1198感染的细胞中提取腺病毒基因组，主要步骤为收集的感染细胞剧烈震荡分散，加入800 μL新鲜配制的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH 7.5，1%SDS，100 μg/mL Proteinase K），37℃孵育1 h，往离心管中逐滴加入5 mol/L的NaCl溶液200 μL，混匀，冰浴1 h以上，离心半径6 cm，14 000 r/min离心5 min取上清，加入1 μg RNaseA处理；依次用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）和氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提，取上层水相，加入1/10体积的3 mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇置-20℃ 30 min，4℃，12 400 r/min离心5 min去上清，70%乙醇洗涤，室温干燥后溶于50 μL TE溶液，保存备用。

1.2.2 试剂盒A提取腺病毒基因组 按照试剂盒说明书提取病毒感染细胞内的腺病毒基因组。

1.2.3 试剂盒B提取腺病毒基因组 按照试剂盒说明书提取病毒感染细胞内的腺病毒基因组。

1.2.4 DNA定量 用紫外分光光度计（NANODROP 2000c，Thermo Scientific）检测基因组DNA浓度，同时记录OD260/OD280比值；腺病毒荧光定量PCR（7500 Real Time PCR system，ABI）方法检测腺病毒基因组拷贝数；为进一步确定抽提的病毒基因组DNA纯度，取2 μL基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.5 DNA限制性酶切和凝胶电泳分析 提取的基因组DNA加入1 μL RNase于37℃孵育5 min，取4 μL，配制10 μL酶切体系，用Hind Ⅲ限制性内切酶（NEB）37℃酶切2 h，取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 病毒拯救 各取1 μg提取的病毒基因组，用脂质体转染试剂（Lipofectamine TMLTX plus reagents，Invitrogen，批号：1581835）转染AD293细胞，转染8 d后收集细胞，冻融3次后转接A549细胞，观察细胞病变效应。

1.3 观察指标

观察各提取方法的耗时（min）、DNA量（μg）、OD260/OD280、基因组拷贝数；3种方法提取的病毒基因组用HindⅢ限制性内切酶酶切后行电泳，观察电泳条带；分析病毒拯救和病毒全基因组克隆构建。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腺病毒基因组提取的3种方法比较

3种方法都可以从细胞中有效提取腺病毒基因组，与Hirt's改良法相比，试剂盒A法和试剂盒B法只需要30 min左右，提取时间显著缩短，提取的DNA含量显著增多，基因组拷贝数更大，其中，试剂盒A法提取的DNA含量最多以及基因组拷贝数最大；3种方法各项目比较，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。见表1。

2.2 DNA限制性酶切分析

3种方法提取的病毒基因组用HindⅢ限制性内切酶酶切后电泳条带都很清晰，背景干净，无降解，与理论酶切图谱相符。见图1。

2.3 病毒拯救和病毒全基因组克隆构建分析

3种方法提取的病毒基因组转染AD293细胞后都能成功拯救出病毒，其中试剂盒A和试剂盒B的病毒拯救效率相似，高于Hirt's法（圖2、表2）。三种提取方法拯救的病毒，其感染A549细胞的生物学特性无差别（图3）。3种方法提取的病毒基因组与穿梭载体在BJ5183感受态细菌内同源重组，全基因组克隆构建的成功次数中试剂盒法最多，与Hirt's改良法相比，提取DNA重组后菌落数试剂盒A法约3800个，试剂盒B法约9000个，菌落数显著提高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

3 讨论

人腺病毒（human adenovirus，HAdV）分为7组共52个血清型、68种基因型，其中1/3的腺病毒能引起成人和婴幼儿呼吸道、胃肠道、眼部等多种感染性疾病，甚至引起心肌炎、脑膜脑炎[1-4]。病毒全基因组限制性酶切分析（restrictionendonucleaseanalysis，REA）是一种简单而且花费少的腺病毒基因型鉴别的方法，广泛用于腺病毒流行病学调查研究及基因工程腺病毒的分型鉴定中。REA实验的进行需要提取高质量的腺病毒全基因组，目前国际上通行的腺病毒基因组提取方法是改良的Hirt's法，该方法虽然避免了大量培养细胞的过程，但依然耗时耗力。

从感染的细胞中提取病毒基因组的标准方法通常要求培养多达几十个T75瓶的病毒，不仅耗时长，且过程复杂[5-7]。Hirt's法则直接从培养的腺病毒感染细胞中抽提病毒基因组，不需要纯化病毒；改良的Hirt's方法冰浴孵育沉淀细胞基因组的时间可缩短至1 h。目前大部分商品化试剂盒是用离心柱吸附病毒基因组，优点是方法简便，不需要使用有机试剂酚/氯仿抽提；缺点是只能用于非细胞样品，这是因为是细胞样品中大量的宿主基因组不易去除[8-11]，相关科研人员不得不使用Hirt's法或改良Hirt's法。目前市售的可直接从细胞样品中提取病毒基因组的商品化的试剂盒较少，提取的病毒基因组一般用于PCR或RT-PCR，对于其他用途鲜有报道[12-14]。本研究购买了来源于两间不同制造商的试剂盒，进行腺病毒基因组提取实验，以期替代传统Hirt's提取方法[15-21]。

本研究首次用這两种试剂盒提取HAdV-7基因组，结果表明两种试剂盒均可以快速、简便、有效的从腺病毒感染细胞中提取病毒基因组，整个过程仅需30 min左右，没有使用有机试剂酚/氯仿，而且提取的病毒DNA量更多，从60 mm培养皿中可以提取多达15～35 μg的病毒基因组DNA，是Hirt's方法提取量的3～7倍。这两种试剂盒也可用于从细胞样品中提取其他种类的病毒全基因组，如疱疹病毒全基因组等。本研究用两种试剂盒方法提取的腺病毒DNA完整性好，可以用于限制性内切酶酶切实验，从60 mm培养皿中提取的病毒DNA可以进行多达35次酶切反应（1 μg/次），而Hirt's法可能只能进行5次左右的酶切反应。两种试剂盒方法和Hirt's法提取的腺病毒基因组都可以用于转染实验和细菌内同源重组实验，但试剂盒方法所获得的菌落数更多。

综上所述，使用市售可用于细胞样本的病毒基因组提取试剂盒所获得腺病毒基因组，不但可用于后续的PCR实验，还可用于全基因组限制性酶切分析、病毒全基因组克隆构建以及病毒拯救，并且试剂盒方法简单、快速、得率高，可替代传统Hirt's提取法和改良Hirt's提取法。

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（收稿日期：2016-09-21 本文編辑：程 铭）