蛛网萼开花物候、花部特征及繁育系统研究

张丽芳　裘利洪

摘要： 为探讨蛛网萼（Platycrater arguta）传粉生物学特性，该研究以江西上饶广丰铜钹山国家级自然保护区、江西阳际峰国家级自然保护区蛛网萼为材料，采用野外观察和人工授粉等方法，对蛛网萼开花物候、花部形态及繁育系统进行了研究。结果表明：（1）蛛网萼为伞形花序，种群花期一般在6月中下旬至8月中旬，单花花期为2～3 d，花序花期持续10 d。两个保护区由于年均温度与光照的不同，花期进程有显著不同。（2）蛛网萼可孕花与不孕花从绿色变为白色时对访花昆虫有吸引作用，不孕花能够增加昆虫的访花频率。（3）蛛网萼花粉胚珠比（P/O）为2 520～3 100，杂交指数即是3或4。（4）繁育体系属于以异交为主，部分自交亲和，需要传粉者；熊蜂（Bombus sp.）、四条蜂（Apis florea）和油茶地蜂（Andrena cammelia）是蛛网萼的有效传粉昆虫。（5）套袋和人工授粉结果显示，蛛网萼为兼性自交和异交授粉，异株异花授粉能显著提高坐果率及结籽率，这主要与生境中有效传粉昆虫种类、数量少，花粉传递效率低，种群间基因流交流降低以及柱头自花及同株异花传粉等有关，从而表明在蛛网萼现有生境中植株的早期生殖成功受到影响。蛛网萼种群分布范围扩张以有性繁殖为主，无性繁殖作为重要补充及繁殖保障。

关键词： 蛛网萼， 传粉昆虫， 繁育系统， 自交衰退

中图分类号： Q941

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）10130111

蛛网萼为绣球花科（Hydrangaceae）蛛网萼属（Platycrater）单种属植物，是日本与亚洲分离以前即存在的孑遗植物（吴征镒等，2003）。目前该属植物分布于中国华东地区如浙江、江西、福建等地和日本南部地区（Qi et al， 2012；毛夷仙等，2016），主要产于海拔300～900 m的山体中下部溪涧边或有滴水阴湿岩旁（乐新贵等，2008；Ge et al， 2007）。由于其特殊的中国—日本间断分布模式对研究东亚植物地理、植物区系有深远科学价值。另外，其花型奇特，花洁白美丽，具有一定观赏价值，适合引种栽培，用于园林涧边阴湿地栽培观赏。然而近年来由于生境的不断破坏，分布区域越来越狭窄，生存受到威胁，于1992年被列入《中国植物红皮书—稀有濒危植物》，为国家二级濒危种（傅立国，1992）。

从20世纪30年代开始国内外陆陆续续出现相关研究，在80—90年代达到高峰期。有关该植物的研究主要侧重在分类学方面，此后有学者利用叶脉序（郝刚和胡启明，1996a）和花粉形態（张定宇和成亚君，1998；郝刚和胡启明，1996b）对其分类地位进行进一步的验证。同时在种群遗传结构和遗传多样性水平（陶晓瑜，2008；祁新帅，2013）等方面也做了深入研究。近几年来，陶晓瑜（2008）研究表明，冰期后蛛网萼种群没有出现明显的扩张，其种群小难于扩张，而且随着越来越频繁人为活动，其生境受到严重破坏，种群不断缩小，急需采取有效的保护措施。然而对于蛛网萼传粉生物学方面的研究鲜有报道，仅张丽芳等（2015）对蛛网萼种子萌发做了相关的研究，而对其花期物候与繁育系统以及传粉者之间的相互影响等方面尚未有研究报道。因此，本研究以蛛网萼为研究对象，在野外开展保护生物学研究，旨在了解该物种的开花物候和繁育系统，探讨蛛网萼传粉过程和生殖成功的影响因素，为该种的有效保护提供科学依据。

1研究地区与研究方法

1.1 研究材料

蛛网萼为落叶小灌木，高0.5～1 m，直立、平卧或匍匐状。根状茎粗壮，沿着石壁缝隙生长或钻入石壁内。在春季开始生殖生长期，分化出1～2个伞房状聚伞花序，于7月或8月陆续开放，花二型，包括可孕花和不孕花，花期一直持续到9月。蒴果，11—12月份成熟，种子多数，纺锤状，两端有翅，翅短。

1.2 研究地点

野外传粉生物学实验地点选择在江西上饶铜钹山国家级自然保护区（118°12′E， 28°10′N）和贵溪阳际峰国家级自然保护区（117°11′E， 27°51′N），两地均处于江西东北部，武夷山西北麓，属亚热带湿润季风气候区。研究区自然环境优越，常年温暖湿润，雨量充沛，年平均降雨量为1 739.4～1 892.7 mm，最大降水高度为1 083 m；湿润指数较高，年平均湿润指数为1.14～2.16，植被典型分布，植物资源丰富，地带性植被为亚热带常绿阔叶林（涂业苟等，2009）。

对两个分布区内蛛网萼种群生境调查表明，由于种群竞争能力差，占据的生态位不断缩小，种群正在迅速减小，开花结实植株生长在石壁上或石缝中，中老龄个体数量相对较多，种群出现衰退趋势；生长的岩浆岩山地下部和山谷，立地条件较差，土层厚度2～10 cm，土壤以山地红壤为主（武弘麟等，2005）；主要伴生树种有木荷（Schima superba）、少叶黄杞（Engelhardia fenzelii）、青冈（Cyclobalanopsis glauca）、紫珠（Callicarpa bodinieri）等。

1.3 研究方法

1.3.1 花期物候观察2014—2015年连续在两个试验点的蛛网萼自然种群内各随机选取30株进行定位、定时观察，根据开花数计算开花物候参数。按照Dafni（1992）标准观察蛛网萼开花进程并对开始时间进行记录：（1）始花期：全株5%以下的花朵盛开；（2）盛花期：全株50%以上花朵开放；（3）开花末期：全株90%的花朵开放，95%的植株开花结束视为花期结束。同时记录始花时间、终花日期、开花高峰日期及每个时期的当日开花数。

1.3.2 单花开花进程调查随机选取30株外界环境干扰小的植株，挂牌标记，挂牌后连续数天定位观察，统计每日植株开花的数量，记录可孕花与不孕花花序形状、大小和颜色的变化以及雄蕊和雌蕊空间位置上的变化（陈香等，2008；黄艳波等，2015；Chen，2007）。

1.3.3 花部特征的观察选取受外界环境干扰小的30株植株，在开花之前挂牌标记，连续数天观察植株开花情况，直到花朵完全开放。观察时着重记录可孕花与不孕花各部位的变化，包括花瓣的伸展、雌雄蕊的变化、柱头变化、花蜜分泌及气味出现和持续的时间，直至凋谢。用游标卡尺测量可孕花和不孕花的各部位，包括可孕花和不孕花的长度、直径，雌雄蕊长度等，并计算各指标的平均值和标准差用于下一步分析（黄利春等，2014）。

1.3.4 花粉—胚珠比（Pollen-Ovule，P/O）花粉胚珠比（P/O）=平均单花花粉总量/平均单花胚珠数。在2014年8月在蛛网萼种群内随机选取20朵花药尚未开裂的花，用FAA固定液固定带回实验室测定。在实验室内取出雄蕊，放入25 mL的烧杯内，用1 mol·L1盐酸水解药壁，再全部转移到10 mL的容量瓶内定容，摇匀，取出约0.1 mL花粉悬液滴在血球计数板上，在显微镜下重复多次统计花粉量，计算出每朵花的平均花粉数量。同时用刀片纵切种子，划开心皮，在解剖镜下统计胚珠的数量。设计3次重复（Cruden，1977）。

1.3.5 杂交指数（Outcrossing index，OCI）估算随机摘取种群内当天开放的30朵花，用游标卡尺对花朵直径，花药和花柱长进行测量，计算花药与花柱比；同时按照Dafni（1992）的方法，通过对花朵的大小和开花行为估算出杂交指数OCI值，以此来判断繁育系统的类型。

1.3.6 柱头可授性测定柱头可授性用联苯胺—过氧化氢法（刘林德等，2004；Dafni，1992）测定。具体方法如下：在开花盛期，采集不同天数的盛开花朵带回实验室，将其雌蕊置于载玻片上，滴加含有联苯胺—过氧化氢反应液溶液，溶液比例为1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水=4∶11∶22体积比，若雌蕊呈现出蓝色并伴有大量气泡出现，雌蕊有活性，反之，则不具有活性。

1.3.7 人工控制套袋实验 为判定蛛网萼自交/异交时的可育性，从2014—2015年，在蛛网萼野生居群内选取生境较好，花期同步的植株进行授粉处理，设置10组处理组进行研究（王崇云和党承林，1999；Eckert &Barrett et al，1994；Lü et al，2010）。 （1）自花授粉：花朵不去雄，开花前套袋，人工辅助自花花粉，检测自交效果；（2）不去雄、套袋，自然自花授粉，以检测自交效果；（3）去雄、不套袋，自然授粉，以检测异交效果；（4）人工异株异花授粉暨单父本实验；

（5）去雄，开花前套100目网袋（防止小型昆虫进入），以检测风媒传粉效果；（6）去雄、去花冠，套100目网袋（防止小型昆虫进入），不人工授粉，以检测风媒传粉效果；（7）去雄、去花冠、开花前不套袋，自然傳粉，以检测花冠和雄蕊的作用；（8）去整个花冠，不套袋，自然授粉，以检测花冠的作用。（9）去雄、套袋，不授粉，以检测花的无融合生殖；（10）去雄、去花被、套袋，不授粉，以检测花的无融合生殖。（11）对照：不去雄、不套袋，自然传粉，用于检测自然条件下的传粉情况。每个处理30朵花，3次重复，共计90朵花。在果实未开裂前进行采收，带回实验室计算坐果率与结籽率（有胚种子数/总胚珠数）。

1.3.8 访花昆虫及其访花频率在野外种群内选取干扰小的6株开花植株，每株植株上选取10朵新开的花，连续5 d进行定点、定时观察，从早上7：00开始，到下午18：00结束，记录访花者的种类、数量，并观察访花昆虫的访花行为和活动规律。以1 h为单个单元观察统计访花者的访花次数，计算访花频率（访花频率=视野内正开放的花朵中被访花者访花的次数/视野内正在开放花朵数），同时用捕虫网捕获昆虫，制成标本，带回实验室进行种类鉴定，在解剖镜下观察昆虫是否携带花粉和携带花粉的部位（刘林德等，2004）。

1.4 统计分析

本研究采用SPSS（SPSS17.0）软件中的oneway ANOVA分析人工控制授粉实验中不同处理间的结实率以及平均种子数。

2结果与分析

2.1 花期物候

通过两个保护区两年定点、定时观察，蛛网萼花期在6月中下旬到8月中旬，花芽萌动期在5月中下旬，初花期在6月下旬或7月中旬，盛花期在7月中下旬，开花末期在7月下旬至8月中旬，也有零星个别在8月底开放（表1）。由表1可知，蛛网萼花期历时19～25 d，但同一年份不同地点的与同一地点不同年份的花期进程和开花持续时间极为不同。铜钹山与阳际峰在2014年花期进程相差3 d，2015年则相差4 d。

两试验地2014年7月平均气温较2015年低4.2 ℃，因此2014年的试验点蛛网萼植株花期均延迟，开花进程延迟3～4 d，而且在同一地区不同生境的花期进程也存在显著不同，2014年铜钹山双溪口（向阳）和三口井（背阴）不同生境的种群植株开花相差7 d。从图1可以看出，蛛网萼在两个不同生境中的开花物候曲线总体趋势有一定相似，为单峰曲线，开花比例在早期有剧烈下降，在末期也出现急剧下降。这说明气温变化、光照时间的长短能使蛛网萼种群的开花进程受到一定影响。

2.2 单花开花进程

蛛网萼单个植株一般形成1～2伞房花序，每个花序有5～10朵可孕花，2～5朵不孕花，也有不孕花缺失的现象。花瓣4枚，白色，偶有5枚，长（0.883±0.119）cm，宽（0.616±0.142）cm。雄蕊50～100枚，几乎等长，长（0.513±0.082）cm。雌蕊2枚，为（0.686 ± 0.091）cm。整个花序持续10 d，单花花期较短，为2～3 d。根据开花进程单花发育过程可分为5个阶段（图2）：花蕾期可孕花花被片紧包，绿色，持续10～20 d（图2：A）；松蕾期花被片裂开松散、

卷曲，白色，花药呈淡黄色，柱头白色，这一时期为1～2 d（图2：B）；盛开期花朵完全开放，白色，花柱伸展并向两边弯曲，花药金黄色，花粉开始散出，这一时期为1～2 d（图2：C、D）；开花后期花朵逐渐萎缩，花被片黄白色，柱头末端变为褐色，保持1～2 d（图2：E）； 谢花期花朵开始凋落，雄蕊开始凋落，花柱变为绿色并宿存，维持2～3 d（图2：F）。不孕花单花花期为3～4 d，其花期一般晚于同一花序上的可孕花，不孕花的花期也包括5个时期（图3）。

2.3 花粉胚珠比

蛛网萼的单花花粉粒为（1 210 000），胚珠为（435 ± 45），计算的平均花粉胚珠比（P/O）为2 520～3 100，按照Cruden（1977）的标准，属于兼性异交类型与专性异交类型（表3）。

2.4 杂交指数

根据Dafni标准，蛛网萼可孕花平均直径为2.62 cm，远大于6 mm，故值为3；雌蕊比雄蕊先熟，赋值为0；雌蕊比雄蕊长，花藥顶端比柱头稍低，故柱头与花药的空间位置是分离的；但也有一部分的花，柱头向两边弯曲而靠近花药，故将柱头与花药的空间位置视为同一高度，赋值为0或1。因此，蛛网萼杂交指数等于3或4（表2）。初步评定其繁育系统为异交型，部分自交亲和，需要传粉者或部分兼性异交，自交亲和，偶尔需要传粉者。

2.5 柱头可授性

在开花前1～2 d（散粉期和初期）柱头就具有可授性，此时柱头未裂，呈浅绿色。4～24 h（散粉期），柱头呈乳白色，伴有大量粘液分泌，在联苯胺-过氧化氢溶液中有大量气泡产生，表明此时柱头过氧化物酶活性较强，过氧化物酶活性也比较明显。而开花后48 h（散粉末期） ，柱头呈绿色，有黏液分泌，然而在联苯胺-过氧化氢溶液中只有少量气泡产生，其过氧化物酶活性减弱；72 h 后，柱头变成褐色同时黏液分泌减少，在联苯胺-过氧化氢溶液中产生极少量气泡，过氧化物酶活性则降到最低（表4）。

2.6 控制套袋实验

在自然状况下，蛛网萼的结实率为（66.30 ± 4.85）%，单个果实平均结籽率为（100 ± 0.75）%；从表4可以看出，处理1和处理2中开花前不去雄、套袋后，自花授粉还是人工授粉，其坐果率和结籽率均低于不去雄，不套袋，自然传粉，表明蛛网萼能进行自交，但只存在部分自交亲和。处理3说明蛛网萼的繁育系统并不是以异交为主，与处理4相比较，处理4的坐果率和结籽率均比处理3大，说明异株异花授粉的结实率和坐果率显著大于对照，从而表明蛛网萼的繁殖系统中传粉者是必须的。

第5个处理与第6个处理的坐果率分别为58.3%和86.7%，但结籽率为11.3%和4.44%，从结籽率来说，风媒未起到作用，蛛网萼的传粉以虫媒为主。去雄、套袋，不授粉和去雄、去花被、套袋，不授粉结实率为0，说明蛛网萼不存在无融合生殖。第7个处理与第8个处理结籽率大小为对照>去冠不去雄>去雄不去冠>去雄去冠，因此花冠对于生殖而言并不是很重要，而雄蕊的存在对于生殖成功是尤为重要的。

2.7 访花昆虫

通过两个试验点定点观察发现，在晴朗无风的天气，蛛网萼的花序有多种访花昆虫，主要访花昆虫包括：熊蜂（Bombus sp.）（图4：D）、四条蜂（Apis florea）（图4：A）、油茶地蜂（Andrena cammelia）（图4：B）、黑带食蚜蝇（Episyrphus balteata）（图4：C）、腰角蚜蝇（Sphiximorpha sp.）（图4：E）、宽带三线蝶（Athyma jina）等。但是由于访花昆虫种类和花的状态不同使昆虫访花行为存在显著差异。开花1 d内，花瓣尚未完全打开，油茶地蜂蜷缩身体倒挂于雄蕊上收集花粉，足部携带明显的花粉框（图4红色箭头指示部分）。而当花朵完全开放时，油茶地蜂与黑带食蚜蝇会直接停留在雄蕊群上。在吮吸花蜜、收集花粉过程中，头部和腿部上的花粉会触碰到柱头从而完成传粉，而腰角蚜蝇则停留在花瓣上未起到传粉作用。

在传粉过程中也观察到不孕花的作用，这种类似的不孕花也存在于忍冬科、珙桐科等植物中。蛛网萼的不孕花在开花过程中由绿色变为白色时，形状与可孕花相似，增强了对昆虫的吸引作用，昆虫访花时，先被白色不孕花吸引，在不孕花上有短暂停留，然后再访问可孕花（图5）。

除此之外，昆虫的传粉行为也极易受到生境中天气状况的影响。在晴天，蛛网萼访花昆虫访花频率相对较高，上午8：00之后陆陆续续出现访花昆虫，

在9：00—9：30之间达到高峰，而在接下来的10：00和下午的14：00之后会再次出现小高峰。昆虫一天内的访花时间主要在8：00—16：00，高峰期在9：00—15：00（图6），雨天无访花者。

3讨论

蛛网萼花朵开放进程受到温度影响很大，温度升高，开花进程提前开始。同时其开花进程也受到光照的影响，在向阳处，提前开放且开花数量增多；背阴处，花期进程延迟，开花数量削减。而且从双溪口和三口井两个种群的开花物候曲线来看，其开花盛期及开花高峰期均有一定的不同，开花物候曲线则有一定相似，均呈现出单峰曲线，表现出“集中式”开花模式。而这种“集中式”开花模式，能够为蛛网萼集中的吸引大量有效的访花昆虫，对花朵进行访问并授粉。由此可知，蛛网萼这类开花模式多是因为长期环境的选择压力下所构成的对环境的适应行为。

根据Dafni和Cruden标准，蛛网萼繁育系统为兼性异交类型与专性异交类型且需要传粉者。根据人工控制套袋实验却表现出能进行自交，但只存在部分自交亲和，仍以异交为主。这可能是由于大部分被子植物本身具有潜在的自交能力，尤其当生境发生剧烈破坏或异源花粉传播受到限制时，更易于接受同源花粉，从而导致其丧失自交不亲和性，而植物的交配系统从异交变为自交，能够提高植物结实率。由此可推断出，蛛网萼虽然自交性低，但在长期进化过程中为适应不断变化的环境，部分自交为该物种提供了一定生殖保障与进化潜力。

植物花部特征可分为花部构成、开花式样两个层次，二者综合作用对传粉者吸引和花粉散布产生影响，开花植物的交配机遇受到影响，同时光照、气温、湿度等因素也会影响传粉昆虫的活动，降低植物的异交授粉几率（周莉花，2004）。蛛网萼在6月至7月开花，在开花过程中花部特征的变化与传粉密切相关，结合本研究可知，蛛网萼的可孕花与不孕花颜色存在从绿色变为白色过程，当变为白色时，有传粉昆虫前来访花，而且两侧的不孕花对蛛网萼传粉起到吸引传粉昆虫的辅助作用。蛛网萼有效传粉者种类少，只有熊蜂、四条蜂与油茶地蜂。同时，蛛网萼的传粉也受到温度与风速等天气状况的影响，本研究中，在上午9点以后，访花者的访花活动逐渐开始，并达到最高峰；而中午传粉者的活动则再次达到高峰，这与蜂类昆虫活动需要达到一定温度的研究结果一致（曹义锋等，2007）。因此，蛛网萼潜在的自交亲和机制与花部综合特征，是确保植株繁殖成功，产生更多种子，是蛛网萼的一种繁殖保障机制。

蛛网萼单花花期2～3 d，当花瓣未完全展开时，未有传粉昆虫进行访花；而当完全开放，才有昆虫进行访花。传粉昆虫落到雄蕊上，自上而下的收集花粉，吮吸花蜜，增加异交的几率。蛛网萼繁育体系属于异交型，部分自交亲和，传粉者必需或部分为兼性异交，自交亲和，偶尔需要传粉者。

在被子植物中花作为重要繁殖器官，为了适应环境而不断进化形成灵活多样的花部行为，保证物种的繁殖与延续（龚燕兵和黃双全，2007）。蛛网萼花朵未开放时，柱头的可授性与花粉活力慢慢开始加强，而当彻底开放时，其花粉活力和柱头可授性达到最高，从而保证传粉的成功。然而降雨及低温等不确定因素极易影响授粉过程，花粉活力和柱头可授性降低。因此，在开花初期，蛛网萼花瓣未完全打开，且雌蕊先熟，从而保证雄性适合度。

在片断化生境中小而孤立濒危植物居群由于遗传多样性丧失等原因将面临很高的灭绝风险（Frankham et al，2002）。生境破坏和片断化使蛛网萼群落处于狭窄的生态位，被排挤到立地条件差的生境中，成熟种子量少，种子繁殖幼苗建成困难。因此，蛛网萼的有性繁殖其实不具有大量繁衍种群的能力，而根状茎作为无性繁殖器官也仅仅使种群保持现有个体数，增加新个体的能力有限。蛛网萼呈现个体数量少及斑块状分布的特点，表明其种群扩张以有性繁殖为主，无性繁殖则作为繁殖保障和重要补充。

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