药物治疗后肾癌EMT相关基因表达谱分析及对预后的影响

南 宁 寨 旭 王 宇 陈 琦

药物治疗后肾癌EMT相关基因表达谱分析及对预后的影响

南 宁 寨 旭 王 宇 陈 琦

目的 通过对相关数据库数据分析，探究EMT相关调节因子的异常表达与肾癌的相关性。方法 对NCBI中GEO数据库中的若干数据集数据进行表达量分析、生存分析和相关性分析。结果 ①研究分析表明，Snai1等EMT相关调节因子在肾癌中存在明显的高表达，而E-cadherin(CDH1)等则表现为明显的低表达。②Twist1等的高表达会导致肾癌患者的总生存率和无疾病生存率明显降低(P=0.0186;P<0.0015)。③VIM和SIP1在药物治疗后的肾癌患者中有明显的高表达情况(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和TJP1在药物治疗后的肾癌患者中则表现为低表达(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)。④VIM和SIP1在肾癌患者中的表达情况呈正相关(P<0.0001，γ=0.573)；而其与OCLN呈负相关(P=0.0017，γ=-0.3316)。结论 通过对EMT指标在肾癌患者中的表达相关性分析表明，EMT调节因子的异常表达与肾癌患者疾病的发展存在一定的相关性，并且对其药物耐受和预后都有一定的影响。

肾癌；表达谱；EMT；预后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:548～552)

肾癌是常见的致死率位于前十的恶性肿瘤之一，其患者仍然在逐年增加[1]。约有30%的肾癌患者在诊断初期就已经发生了转移，且由于耐药性的存在，转移性肾癌患者5年生存率仅为5%[2]。虽然目前一些靶向治疗药物可以在一定程度上改善预后，但对于很多恶性肾癌仍然无法治愈[3]。所以鉴定驱动肾癌生长转移的分子生物学事件对于发展最佳的治疗策略是至关重要的。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种上皮样细胞向间质样的细胞转分化的过程，与上皮细胞恶性肿瘤的发生发展关系密切[4]。实验证据表明EMT在多种癌症的原发性浸润和继发性转移中起着举足轻重的作用[5],其相关基因的表达还对于肿瘤的耐药起着非常重要的作用[6]。有研究提示EMT相关的基因，如Twist的表达与肾癌的转移以及耐药有着密切的关系[7]。而完整的EMT信号网络是由细胞外信号触发，如转化生长因子(transforming growth factor β，TGF-β)信号[8-9]，这些转录因子同肿瘤的侵袭和转移以及肿瘤耐药性的发展密切关联[10]。目前仍没有研究直接证明他们之间的联系，故在本研究中我们探究了肾癌病例中相关EMT调节因子的异常表达情况，并分析了EMT调节因子的异常表达与肾癌耐药的相关性及对肾癌预后及生存的影响。

1 材料与方法

1.1 研究材料

本研究所用到的材料均来自于NCBI的GEO数据库，具体信息如下。

表1 研究中所用到的GES数据集

1.2 方法

1.2.1 表达量分析 基于数据库特定研究样本数据集中特定目标基因的表达量的相对值进行表达量的分析，所有数据都经过对数转换和中位数中心化处理。根据表达量处理后数据进行聚类和差异分析。文中热图由HemI软件制作，比较差异分析图由GraphPad Prism 5软件制作。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示差异有统计学意义)。

1.2.2 生存分析 基于数据库特定研究样本数据集中特定目标基因的表达量的相对值及对应样本的总生存(OS)和无疾病生存(DFS)信息进行生存分析，所有数据都经过对数转换和中位数中心化处理，并采用Kaplan-Meier分析方法进行分析。

1.2.3 相关性分析 基于数据库特定研究样本数据集中特定目标基因的表达量的相对值进行相关性分析，所有数据都经过对数转换和中位数中心化处理。(P<0.05表示差异有统计学意义，γ<0表示负相关，γ>0表示正相关)。

2 结果

2.1 EMT相关指标在肾癌患者中的表达分析

为了评估EMT与肾癌发生发展的关系，我们选取了6个EMT相关的调节因子，分别为Snai1、Twist1、vi mentin(VIM)、SIP1、E-cadherin(CDH1)和occludin (OCLN)，据以往的相关研究表明，其中Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在EMT的过程中表达量上调，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)在EMT的过程中表达量下调。据此，我们对研究数据集中的肾癌样本和正常肾组织样本的相关基因的表达进行了表达谱的聚类分析，结果表明Snai1、Twist1、VIM和SIP1在肾癌样本中均存在高表达，而E-cadherin和occludin在肾癌中均表现为低表达，这也与以往的类似研究结果相一致，表明EMT对于肾癌的发生发展有着重要的作用。

2.2 EMT相关指标对肾癌患者生存及预后的影响

据以往的研究报道，EMT过程对于肾癌的发生发展以及肾癌患者的生存状态具有重要作用。所以，为了进一步探究EMT相关调节因子的表达对肾癌患者的生存状态的影响，我们对上述部分基因进行了相关研究，结果表明，在肾癌患者中，SANI1的高表达会导致肾癌患者的总生存率明显降低(P<0.0001)，并且在肾癌患者中，SANI1的高表达也同样会导致肾癌患者的无疾病生存率明显降低(P=0.0071)。与此类似，我们也在同样的数据集中对Twist1的高表达对非小细胞肺癌患者的总生存率和无疾病生存率进行了分析，结果表明，Twist1的高表达同样也会导致肾癌患者的总生存率和无疾病生存率明显降低(P=0.0186;P<0.0015)(图1)。

2.3 EMT相关指标在药物治疗后肾癌患者中的表达分析

在上述的研究中，我们分析了EMT相关指标在肾癌患者中的表达异常情况，以及部分基因的高表达对肾癌患者总生存率和无疾病生存率的影响。为了研究药物治疗后肾癌患者中EMT相关调节因子的表达情况，我们在相关数据集中对部分上述高表达(VIM和SIP1)和低表达(CDH1和OCLN)的基因进行了表达量的比较分析。结果表明，与在肾癌患者中的表达情况相似，VIM和SIP1在药物治疗后的肾癌患者中也有明显的高表达情况(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和OCLN在药物治疗后的肾癌患者中则同样表现为低表达(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)(图2)。这一结果说明，EMT过程不仅对肾癌的发生发展有着重要的影响，而且其在药物治疗后肾癌患者中也表现出同样差异表达情况，暗示其在肾癌的耐药性发展过程中也发挥着同样重要的作用。

图1 EMT相关调节因子的表达与肾癌患者生存状态的分析

图2 EMT相关调节因子在耐药性肾癌患者中的表达差异比较

2.4 EMT相关指标在肾癌患者中表达的相关性分析

为了进一步探究，EMT的相关基因的差异表达与肾癌耐药发展的相关性，我们在耐药性肾癌患者样本中进行了EMT的相关基因的表达的相关性分析。结果表明，VIM和SIP1在肾癌患者中的表达情况呈正相关(P<0.0001，γ=0.573)；而其与OCLN的相关性分析显示呈负相关(P=0.0017，γ=-0.3316)(图3)。这一结果进一步说明，EMT的相关调节因子在耐药性肾癌患者中的差异表达是有关联的，而且这一关联与肾癌耐药性的发展也有着密切的关系，很可能EMT就是肾癌转移乃至产生药物耐受的关键性步骤，通过EMT来促进肾癌的发展恶化，并影响患者的生存及预后。

图3 EMT相关指标在耐药性肾癌患者中的表达相关性分析

3 讨论

EMT过程的进行由多个步骤组成，该过程的实现对于恶性肿瘤的多种恶化事件都具有促进作用，包括肿瘤生成、肿瘤浸润、肿瘤转移和肿瘤的药物耐受等。因此，一些包括表皮标志物、间质标志物和转录因子在内的调节因子均参与这一过程[11]。而且这些调节因子对于EMT的调控存在着不同的模式，这与EMT在恶性肿瘤的早期阶段所存在的时间和空间上的异质性有关[12]，因此，肿瘤EMT相关的调节因子的鉴定和研究是必要的。目前关于 EMT 的研究逐渐深入，其在肾癌中发挥的作用不断地被发现，EMT 发生的分子机制也不断地被揭示[13]。在该研究中，我们着重于6个已知的EMT相关调节因子在肾癌组织中表达的研究，这些调节因子对于肾癌的发生发展、转移耐药及预后生存都有着重要的作用，探究它们与肾癌的关系，对于肾癌的诊断和治疗都具有重要的意义。

我们的研究分析表明，Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在肾癌患者中存在明显的高表达，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)则表现为明显的低表达，且这些基因的表达异常与肾癌患者的生存及预后有着密切的关系，这一结果也与以往的一些研究结果相一致。基于此，我们又对耐药性肾癌病例样本进行分析，发现部分EMT相关的基因在耐药性肾癌患者中也表现出明显的表达异常，该结果证明多因子调控的EMT过程，不仅对于肾癌的发生发展有着重要的促进作用，而且对于肾癌的耐药性也具有一定的作用。

最后，通过对EMT相关调节因子在肾癌患者中的相关性分析表明，EMT调节因子的异常表达之间存在明显的相关性，某些促进EMT进程的调节因子会抑制某些促凋亡因子的表达，同时促进某些促增殖因子的表达。随后，我们比较分析了EMT相关调节因子的异常表达对肾癌患者预后生存的影响。单一变量分析显示，Twist和vimentin等EMT正向调控因子的高表达降低了肾癌患者的总的生存期，同时促进了肾癌患者的治疗后疾病的复发。尽管没有研究表明Twist与肾癌患者预后相关，但是Twist作为一个重要的细胞内转录因子，通过转录抑制E-cadherin的表达，从而使得E-cadherin所介导的细胞间连接缺失，促进细胞运动转移[14]。我们的研究分析结果同样也与这一结论相一致，包括Twist在内的部分EMT相关调节因子对于肾癌的转移和恶化都存在促进的作用。最终，我们提出部分EMT相关调节因子的高表达会导致肾癌患者总生存期降低，同时也会使得患者的无复发生存期降低。

通过对本研究结果的分析讨论，我们评估了多种参与EMT过程的调节因子在肾癌中的重要性，同时也在一定程度上揭示了多因子调控的EMT过程与肾癌的发生发展以及肾癌患者的预后生存等存在着密切的联系。这将为肾癌相关标志物的选择和肾癌患者的诊断治疗提供一定理论基础。

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(编辑：甘 艳)

Analysis of EMT-related Gene Expression Profile and Prognosis of Renal Cell Carcinoma after Drug Treatment

NANNing，ZHAIXu，WANGYu，etal.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity，Xi'an,710004

Objective To study relevant database data analysis,and explore the correlation of the abnormal expression of EMT related factors and renal cell carcinoma.Methods Based on some data sets of GEO in the NCBI database,to perform express analysis,survival analysis and correlation analysis.Results ①The results showed that Snail1 and other EMT-related regulatory factors in renal cell carcinoma patients were significantly higher expression,while the E-cadherin(CDH1)and so the performance was significantly lower expression.②Twist1 and other high expression of renal cancer patients will lead to the overall survival and disease-free survival was significantly reduced(P=0.0186;P<0.0015).③VIM and SIP1 were significantly higher in patients with renal cancer after drug treatment(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021),while CDH1 and TJP1 showed low expression in renal cancer patients after drug treatment(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001).④There was a positive correlation between the expression of VIM and SIP1 in renal cell carcinoma(P<0.0001,γ=0.573)and negative correlation with OCLN(P=0.0017,γ=-0.3316).Conclusion The correlation analysis between the EMT index and the expression of RCC in RCC patients showed that the abnormal expression of EMT regulatory factor is correlated with the development of RCC and has certain influence on drug tolerance and prognosis.

Kidney cancer;Expression profile;EMT;Prognosis

710004 西安交通大学第二附属医院

陈 琦

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.008

R737.11

A

1001-5930(2017)04-0548-05

2016-11-09

2017-03-12)